肝素對高氧致支氣管肺發(fā)育不良新生鼠血清及肺組織中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)的影響

盛安群 陳翠娥 孫媛媛 張希希 錢燕 朱融和 周愛華 王楸 馮建華

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonarydysplasia，BPD）是胎齡＜32周早產(chǎn)兒最常見的并發(fā)癥，由高氧、感染、炎癥、機械通氣等多因素引起，易繼發(fā)肺炎、肺動脈高壓等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患兒生長發(fā)育及生存質(zhì)量[1-4]。近年來隨著早產(chǎn)兒救治成功率的不斷升高，BPD發(fā)病率逐年升高[5]。但治療BPD的措施仍十分有限，且療效欠佳。中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）是中性粒細(xì)胞釋放到胞外的包含有游離DNA、組蛋白、髓過氧化物酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是區(qū)別于凋亡與壞死的另一種細(xì)胞死亡方式[6]。NETs是機體重要的免疫防御機制，但其過度釋放或清除不及時，NETs相關(guān)效應(yīng)分子則會導(dǎo)致組織損傷、器官功能失調(diào)或衰竭。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在多種炎性肺疾病（如囊性肺纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征、肺氣腫、輸血相關(guān)性急性肺損傷等）中，均伴有NETs高表達(dá)及清除減少[7-11]。本研究建立高氧致BPD新生鼠模型并檢測其血清及肺組織中NETs變化，以進(jìn)一步探討NETs在BPD發(fā)病機制中的作用，同時采用肝素干預(yù)并分析其對NETs的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 取SD成年大鼠[體重180～200g，購自上海實驗動物中心 SCXK（滬）2012-0002]，以雌雄比 3∶1合籠交配，每日清晨對雌鼠行陰道分泌物涂片、鏡檢，發(fā)現(xiàn)精子細(xì)胞后分籠飼養(yǎng)直到自然生產(chǎn)；取自然生產(chǎn)的48只新生SD大鼠為實驗對象，體重6～7g。本實驗得到溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的許可。

1.2 主要儀器和試劑 氧艙自動控制系統(tǒng)（溫州醫(yī)科大學(xué)機能實驗中心自制），測氧裝置（TRD-2E1500B，德國 Envite C-Wismar公司），控氧儀（24h HBO-2B，浙江建德梅城電化分析儀器廠），二氧化碳檢測儀（S80053，德國Envite C-Wismar公司），共聚焦顯微鏡（FV1000，日本OLYMPUS公司），熒光酶標(biāo)儀（POLARstar OPTIMA，德國BMG公司）。定量PicoGreen dsDNA試劑盒（P7589，加拿大Invitrogen公司），抗組蛋白H3抗體（SC51716，美國Santa Cruz公司），抗髓過氧化物酶抗體（GB11224，武漢谷歌生物科技有限公司），肝素鈉注射液（G2016，江蘇千紅生化制藥股份有限公司）。

1.3 動物分組與處理 將新生鼠隨機分為空氣組、高氧組、肝素組（O2+肝素）、對照組（O2+0.9%氯化鈉溶液），每組12只。空氣組置于空氣中，其他3組置于氧濃度為90%的高氧箱7d建立BPD模型。肝素組于造模開始后，每天腹腔注射低劑量肝素（250U/kg）至造模結(jié)束；對照組每天腹腔注射約25μl 0.9%氯化鈉注射液。室溫控制在（25±2）℃，濕度維持在 50%，給予動物 12h光/暗交替的環(huán)境，保證飼料和水充足，每日開箱1h。分別在出生后第7、14天每組各取6只，水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速切開左頸部皮膚，分離出頸總動脈，采集血液標(biāo)本，并置于含3.8%枸櫞酸三鈉的EP管中，離心后吸出血清，置于-80℃冰箱保存，用于血清游離DNA水平檢測。切開新生鼠胸前皮膚，鈍性分離皮下組織、肌肉，切斷肋骨，打開胸腔，暴露肺組織，結(jié)扎右側(cè)支氣管，4%多聚甲醛溶液灌注左肺并固定，置于4℃冰箱保存，用作肺組織形態(tài)學(xué)分析及共聚焦纖維成像。

1.4 血清中游離DNA水平檢測 采用熒光染色法。使用PicoGreen雙鏈DNA熒光定量測定試劑盒檢測血清中游離DNA水平。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品儲液和樣品，每孔50μl加入到96孔板，加入PicoGreen熒光染料100μl，室溫避光2～5min，熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算cf-DNA/NETs，即游離DNA水平。

1.5 NETs免疫熒光染色及觀察 取左肺組織，石蠟包埋，4μm切片，脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液提取抗原，0.1%Triton X-100滲透10min，封閉標(biāo)本，抗瓜氨酸組蛋白H3（1∶100）、抗髓過氧化物酶抗體（1∶500）4℃孵育過夜，PBS清洗，二抗（1∶400）37 ℃孵育 1h。采用 4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）避光染色 5～10min、90%甘油封片，共聚焦顯微鏡成像并觀察切片熒光信號范圍。

1.6 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 取左肺中葉，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，4～5μm切片，HE染色，觀察肺組織形態(tài)變化。在光鏡下攝片，計數(shù)肺泡輻射狀計數(shù)（RAC）[12]和平均內(nèi)襯間隔（MLI）[13]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組新生鼠血清中游離DNA水平比較 出生后第7、14天，高氧組、對照組新生鼠血清游離DNA水平明顯高于空氣組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；肝素組新生鼠血清游離DNA水平明顯低于高氧組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 4組新生鼠血清中游離DNA水平比較（ng/ml）

2.2 4組新生鼠肺組織熒光顯微鏡下NETs變化 出生后第7、14天新生鼠肺組織NETs免疫熒光染色觀察，與空氣組比較，高氧組和對照組肺組織組蛋白、髓過氧化物酶熒光信號范圍明顯增加，提示NETs數(shù)量增加，見圖1；這證實高氧暴露會增加肺組織損傷。肝素組與高氧組相比較，熒光信號范圍減少；與空氣組比較差異不明顯，提示肝素干預(yù)可以減輕肺組織NETs形成。

圖1 4組新生鼠肺組織熒光顯微鏡下NETs變化

2.3 4組新生鼠肺組織形態(tài)學(xué)比較 隨著鼠齡增加，空氣組新生鼠肺組織發(fā)育逐漸成熟，肺泡明顯增多；高氧組、對照組在第7天即可觀察到肺泡簡單化，即肺泡壁變薄，部分肺泡融合，第14天時肺發(fā)育依然受阻明顯，肺泡腔擴大，數(shù)目減少，結(jié)構(gòu)紊亂，提示肺組織發(fā)生了類似BPD的病理改變；肝素組肺泡發(fā)育受阻不明顯，見圖2。出生后第7、14天，與空氣組比較，高氧組、對照組新生鼠RAC明顯減少，MLI明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與高氧組比較，肝素組RAC明顯增加，MLI明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；肝素組與空氣組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 4組新生鼠肺組織RAC及MLI比較

圖2 4組新生鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，×100）

3 討論

BPD是極低出生體重兒常見的呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患兒的生存質(zhì)量[5]。BPD病因復(fù)雜，其中早產(chǎn)兒肺發(fā)育不完善是BPD的發(fā)病基礎(chǔ)，其他因素如高氧、機械通氣、感染、炎癥等均可加重BPD。中性粒細(xì)胞是人體固有免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，在BPD發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，中性粒細(xì)胞的聚集和激活是引起肺部毛細(xì)血管和肺泡損傷的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，高氧暴露后新生鼠肺組織中性粒細(xì)胞明顯增多，肺組織明顯受損；而通過減少或清除肺內(nèi)中性粒細(xì)胞后，肺組織受損情況可出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)[14]。

NETs是由德國科學(xué)家Brinkmann等[15]發(fā)現(xiàn)的，它是活化的中性粒細(xì)胞釋放到胞外的，包含DNA、組蛋白、髓過氧化物酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G等構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。它的形成是區(qū)別于凋亡和壞死的另一種細(xì)胞死亡方式，NETs介導(dǎo)的殺滅途徑是人體重要的天然免疫應(yīng)答機制，組織中NETs的誘捕作用能使機體有效防御病原體感染，減少病原體向血液擴散。然而，如果機體局部出現(xiàn)高濃度NETs，即可誘導(dǎo)大量胞外組蛋白釋放，同時誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凝血功能障礙和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織損傷、器官功能失調(diào)或衰竭。既往研究發(fā)現(xiàn)，多種炎癥性肺疾病，包括囊性肺纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征等均伴有中性粒細(xì)胞及NETs高表達(dá)，且清除減少[10-11，16-19]。Saffarzadeh 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，NETs可直接導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞死亡，其細(xì)胞毒性呈劑量依賴性；同時抗組蛋白抗體及髓過氧化物酶抑制劑可明顯改善NETs引起的細(xì)胞毒性。本研究檢測了高氧致新生鼠BPD模型血清及肺組織中NETs水平，結(jié)果顯示血清中游離DNA水平及肺組織NETs數(shù)量均明顯升高；這提示NETs過度表達(dá)介導(dǎo)了BPD發(fā)病，為BPD發(fā)病機制提供了新的理論依據(jù)。

肝素是一種酸性黏多糖，帶負(fù)電荷；組蛋白是真核生物細(xì)胞染色質(zhì)中的堿性蛋白質(zhì)，帶正電荷。肝素可直接結(jié)合組蛋白，并能有效減輕組蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)[21-22]。近期多項研究結(jié)果提示，肝素可與細(xì)胞外組蛋白結(jié)合，降低NETs的活性，從而削弱NETs介導(dǎo)的凝血作用和感染相關(guān)的血管功能障礙，減輕NETs的生物毒性反應(yīng)[21]。非抗凝血肝素也可以與組蛋白結(jié)合，抑制組蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，并可降低無菌性炎癥和膿毒癥小鼠模型的死亡率[23]。低分子肝素亦可阻止活化的中性粒細(xì)胞自噬誘導(dǎo)和NETs的形成[24]，對膿毒血癥所致的急性肺損傷具有良好的治療作用。本研究結(jié)果顯示，高氧暴露可導(dǎo)致新生鼠肺泡發(fā)育停滯，表現(xiàn)為RAC下降、MLI升高；而肝素干預(yù)后，肺泡發(fā)育停滯改善，RAC升高，MLI下降，同時NETs水平明顯下降。

綜上所述，NETs在BPD發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，而肝素可通過中和胞外組蛋白、破壞NETs結(jié)構(gòu)來達(dá)到改善BPD的作用。本課題從全新的角度闡明了肝素在BPD治療中的作用，為其臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供了一定的理論依據(jù)。