利用SSR標記對不同耐鹽紫花苜蓿遺傳多樣性分析

麻冬梅， 張喜斌， 黃 婷， 王文靜， 趙麗娟， 馬巧利

(寧夏大學西北土地退化與生態系統恢復省部共建國家重點實驗室培育基地/西北退化生態系統恢復與重建教育部重點實驗室/寧夏大學生命科學學院/寧夏大學農學院， 寧夏 銀川 750021)

近幾十年隨著工業化步伐的不斷加速以及人們不合理的開發利用，導致了生態環境的不斷惡化，其中土壤鹽漬化程度不斷加深擴大已經成為人類面臨的世界性問題，土壤鹽漬化嚴重的制約著生態環境和農業及畜牧業的發展[1]。因此選育優良的苜蓿耐鹽新品種對改善草地環境提高草地肥力具有重要的生態意義。分子標記輔助選擇(Marker assisted selection,MAS)快速、準確且不受環境因素的干擾，大大提升了育種的效率、縮短了育種周期。目前已經成為了小麥(TriticumaestivumL.)、水稻(OryzasativaL.)、大豆(Glycinemax(L.) Merr.)、高梁(Sorghumbicolor(L.) Moench)等作物育種的重要手段。

簡單重復序列(Simple Sequence Repeats,SSR)包含的多態性信息含量高，共顯性標記、易操作、耗費低、實驗結果可靠等優點，已廣泛用于各種作物的遺傳多樣性研究中[2-3]。它是研究遺傳多樣性最有效的方法之一[4]。目前，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)微衛星的研究相對滯后，已經開發出的分子標記和能夠利用的標記較少。吳宗懷[5]利用SSR標記技術，研究了6份苜蓿的遺傳多樣性，結果表明 6份材料在群體內具有較高的變異。Diwan等[6]在四倍體苜蓿基因組中篩選出4個SSR位點符合孟德爾分離規律。張棟[7]利用3對SSR引物構建苜蓿指紋圖譜，應用于品種鑒定。武自念等[8]利用SSR分子標記對80份多葉苜蓿自交一代自交系單株進行分子檢測，結果表明SSR標記聚類結果可以給田間選擇帶來指導作用。Herrmann等[9]利用SSR標記顯示在四倍體紫花苜蓿群體中最合適樣本量為 40 個基因型，能反映出這個群體的遺傳多樣性。遺傳多樣性是指基因的變化是生物個體基因中蘊藏的遺傳信息的總和，遺傳多樣性的研究是遺傳資源保存利用的前提條件[10]。本研究對評價出的耐鹽材料與敏鹽材料利用分子標記的方法對其遺傳多樣性進行比較,目的在于快速鑒定出不同紫花苜蓿品種耐鹽性差異及它們之間的遺傳多樣性，為紫花苜蓿新品種的選育、種質資源的開發、雜交親本的選配，分子標記的開發、耐鹽相關基因的發掘提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗紫花苜蓿品種材料由甘肅農業大學曹致中老師惠贈。前期從50份紫花苜蓿品種材料中通過表型鑒定的方法篩選出的5份耐鹽品種、5份敏鹽品種為試驗材料。并根據初步篩選出品種的葉綠素含量、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活性及丙二醛含量進行綜合評價,依據綜合評價值(D值) 對耐鹽性進行強弱排序,按由強到弱排列如下：“阿迪娜”>“巨能”>“巨能7號”>“抗旱15”>“騎士T”>“Asi”>“興平”>“秘魯”>“草原3號”>“國產苜蓿”。每個品種隨機取50個單株，共500份樣品。(見表1)

表1 供試紫花苜蓿材料Table 1 Alfalfa accessions

1.2 試驗設計

剪取每個供試材料的嫩葉約0.3 g，采用Plant Genomic DNA Kit(北京天根)試劑盒來提取每株材料的基因組DNA。將提取的基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

試驗所用的SSR引物均從已發表的相關文獻中查得[11-14]，并由上海生工技術服務有限公司合成。將每份材料的基因組DNA取等量混合，對每對引物進行梯度PCR反應擴增，將擴增產物經過8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，選擇具有多態性條帶的引物備用。

SSR擴增反應體系為：2 μL模版，上游和下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL總計25 μL體系；SSR反應擴增程序為：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，48 ℃～56 ℃退火45 s(不同引物的退火溫度不同)，72 ℃延伸60 s，共35個循環，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

將試驗所得的聚丙烯酰氨凝膠電泳條帶采用0/1法進行統計，構建1/0二元矩陣[15]，并計算等位基因頻率，便于后期指標計算。

1.3 計算指標

(1)多態位點百分率[16]

多態位點百分率=單態位點數/總位點數；

(2)雜合度[10]

群體內某一位點的雜合度

平均雜合度

上述公式中，Pi表示某一位點上第i個等位基因頻率，n為某一位點的等位基因數，hj為第j位點的雜合度，r為位點個數。

(3)香農指數(Shannon-Wiener，I)[12]

I=∑piInPi

，

上述公式中，Pi表示某一位點上第i個等位基因頻率。

(4)多態信息含量(Polymorphism Information Content，PIC)[10]

多態信息含量(PIC)采用PIC-CALC軟件進行計算。

(5)平均有效等位基因數[10]

PNe/A0=Ne(A0)-1

上述公式中，Pij：第i座位上第j個等位基因頻率；m：第j個座位的等位基因數；Nei：第i個座位上的等位基因有效數目；n：所測座位的總數；Ao為等位基因觀察數；PNe/Ao為有效等位基因數與等位基因觀察數的比值，其范圍為0～1。

(6)遺傳分化系數(Gst)[12]

Gst=Ht-Hs(Ht)

上述公式中，Ht為材料的總基因多樣性，Hs為材料內基因多樣性。

(7)遺傳距離(Ds)

Nei，s標準遺傳距離(Nei，s standard genetic distance，Ds)[17-18]

上述公式中，xiyi表示第i條帶分別在群體X，Y中出現的頻率。

(8)遺傳相似系數(Gs)[17-18]

Gs=1-Ds

上述公式中，Ds為Nei，s標準遺傳距離。

(9)聚類分析

利用MEGA6.0軟件對遺傳距離(Ds)進行UPGMA聚類分析[9]。

(10)數據整理

數據整理用Microsoft Excel 2003軟件，數據處理采用IBM SPSS Statistics19軟件。

2 結果與分析

2.1 多態性引物

本試驗共收集到了35對SSR引物，經過篩選獲得具有多態性且條帶清晰的SSR引物有9條，見表2。

表2 9對呈多態性紫花苜蓿微衛星引物信息Table 2 The information of 9 pairs of miscrosatellite primers with polymerp hism in alfalfa

2.2 擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

部分擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜見圖1。

2.2 群體內的遺傳變異分析

2.2.1品種內多態位點百分率(Percentage of polymorphic loci)分析 多態位點百分率就是多態位點數占總位點數的比率，它可以反應群體遺傳多樣性的大小。每個擴增片段作為一個位點，對每一個位點來說當它的比率大于1%時，則此位點就是多態性位點[12]。10個紫花苜蓿品種的平均多態位點百分率統計于表3。由表3可知，10個品種中“阿迪娜”的平均多態位點百分率最高為71.80%，“秘魯”的平均多態位點百分率最低為47.1%；10個紫花苜蓿品種的平均多態位點百分率均大于1%，所以10個紫花苜蓿品種表現出高多態性。

圖1 位點AFctt1在巨能擴增檢測Fig.1 Banding Patterns of AFctt1 in the alfalfa注：圖中各泳道編號為巨能苜蓿單株材料編號Note:The lane Numbers are the individual plant material Numbers of Magnum

表3 10個紫花苜蓿品種群體內的遺傳變異Table 3 Genetic variation in 10 alfalfa Varieties

2.2.2品種內有效等位基因數(Effective allele number)分析 有效等位基因數是反應群體遺傳變異大小的一個重要指標，它能夠很好的反映在群體中起作用的等位基因數目，等位基因在群體分布的越均勻，有效的等位基因數目就越接近所檢測到的等位基因數的觀察值[14]。

10個紫花苜蓿品種的有效等位基因數與等位基因觀察數的比(PNe/Ao)統計結果見表3。由表3可知10個紫花苜蓿品種的有效等位基因數與等位基因觀察數的比(PNe/Ao)范圍為0.680～0.890，說明這10個紫花苜蓿品種等位基因在群體分布比較均勻；其中品種“巨能”的PNe/Ao最高為0.890，品種“草原3號”的PNe/Ao最低為0.680。

2.2.3品種內雜合度(Heterozygosity)分析 雜合度，它是反應群體在多各位點上的遺傳變異，是度量群體內遺傳變異的一個參數。其數值的大小反映了群體內個體的均勻度，數值越大群體內的遺傳變異就越大，數值越小群體內的遺傳變異就越小[10]。10個紫花苜蓿品內的平均雜合度統計結果見表3。由表3可知10個紫花苜蓿品種的平均雜合度在0.759～0.822之間，其中“巨能7號”的平均雜合度最高達到了0.828，“國產苜蓿”的平均雜合度最低為0.759；說明這10個紫花苜蓿品種的遺傳變異較大，有利于對材料進行研究分析。

2.2.4品種內香農指數(Shannon Index)分析 香農指數是評價種群遺傳分化的重要指標，種群內的遺傳分化可用香農指數進行估算，指數越大遺傳多樣性越大，種群的分化程度越高[12]。

10個紫花苜蓿品內的香農指數據統計結果見表3。由表3可以看10個紫花苜蓿品種的平均香農指數在1.753～1.976之間，說明這10個紫花苜蓿品種的遺傳分化程度較大；其中“巨能7號”的平均香農指數最高達到了1.976，“國產苜蓿”的平均香農指數最低為1.753。

2.2.5品種內多態信息含量(Polymorphism Information Content)分析 多態信息含量是表示微衛星位點變異程度大小的一個指標，當PIC>0.5時，則該位點為高多態性；當0.25

10個紫花苜蓿品種內的平均多態信息含量(Average PIC)統計結果見表3。由表3可以看出10個紫花苜蓿品種的Average PIC在0.735～0.811之間，10個品種的Average PIC的平均值均大于0.5，說明這9條引物可為這10個品種提供理想的信息；其中“巨能7號”的Average PIC最大為0.811，“國產苜蓿”的Average PIC最小為0.735。

2.3 群體內的遺傳變異綜合分析

2.3.1各單項指標及相關性分析 將10個紫花苜蓿品種的平均多態位點百分率、雜合度、有效等位基因數與等位基因觀察數的比(PNe/Ao)、香農指數、PIC的平均值統計結果見表4。在將上述5個指標的平均值用IBM SPSS Statistics 19進行處理得到相關系數矩陣結果見表5。由表4可以看出各品種各指標均不相同，其中“巨能7號”的雜合度、香農指數、多態性息含量(PIC)均比其他品種高；“阿迪娜”的多態位點百分率比其他品種高；“騎士T”的PNe/Ao比其他品種高。因此用單項指標不能準確的反應出各品種內的遺傳變異大小，因此需要進一步進行綜合分析。由表5可以看出各指標之間存在不同程度的的相關性，說明他們之間所提供的信息發生相互重疊，需要對實驗數據進一步分析。

表4 10個紫花苜蓿品種各單項指標Table 4 The single index of 10 Alfalfa Varieties

表5 10個紫花苜蓿品種各單項指標的相關系數矩陣Table 5 Correlation coefficient matrix of the single index of 10 Alfalfa Varieties

2.3.2主成分分析 對5個單項指標的遺傳變異大小進行主成分分析，由表6可以看出5個單項指標濃縮為2個指標，這2個指標累計貢獻率為 84.686%，說明這2個指標攜帶了原始數據的絕大部分信息。

表6 10個紫花苜蓿品種綜合指標系數及貢獻率Table 6 Comprehensive index and contribution rate of 10 Alfalfa Varieties

2.3.3隸屬函數分析及權重、D值的確定 由表7可以看出，對于同一個綜合指標CI2可知巨能的u(X2)最大為1，說明此品種在CI2中遺傳變異程度最大。綜合指標的權重(wj)分別為 0.715，0.285。其中巨能的綜合指標D值最大為 0.943。

表7 10個紫花苜蓿品種各品種綜合指標值、權重、u(Xj)，D值Table 7 Comprehensive index value,weight,u (Xj),D value of 10 Alfalfa Varieties

2.3.4品種內遺傳變異綜合評價 經主成分分析及隸屬函數計算求出綜合指標評價D值，由綜合指標評價D值可以看出品種“巨能”內的遺傳變異程度最高為0.943；品種“國產苜蓿”內的遺傳變異程度最低為0.146。其它品種內的遺傳變異程度大小為：“巨能”>“騎士T”>“巨能7號”> ‘Asi’>“興平”>“阿迪娜”>“秘魯”>“抗旱15”>“草原3號”>“國產苜蓿”。

2.4 群體間的遺傳變異分析

2.4.1群體間的遺傳分化 由表8可知10份紫花苜蓿材料的總基因多樣性(Ht)為0.887，品種內的基因多樣性(Hs)為0.799，品種間的遺傳分化系數(Gst)為0.100。即有90%的遺傳變異發生在品種內，品種間的遺傳變異只占10%，由此說明10份紫花苜蓿材料的絕大部分遺傳變異都發生在各品種的內部。

表8 10份紫花苜蓿材料間遺傳分化的SSR分析Table 8 SSR genetic differention analysis alfalfa materials

2.4.2品種間的遺傳距離和遺傳相似性系數分析 遺傳距離和遺傳相似系數是衡量群體之間遺傳變異的指標，它們都是基因頻率的函數。遺傳其中遺傳相似系數是表示群體間的相似程度。由表9可知，“巨能7號”/“巨能”之間的遺傳相似性系數最大為0.893，說明它們兩個品種間的相似程度最高；“秘魯”/“興平”之間的遺傳相似性系數最小為0.118，說明它們兩個品種間的相似程度最低。

表9 各位點各群體的標準遺傳距離(Ds)和相似系數(Gs)Table 9 Standard genetic distance (Ds) and genetic resemble coefficient of each variety (Gs)

注：上三角為遺傳相似系數(Gs)，下三角為遺傳距離(Ds)

Note:The genetic resemble coefficient is above diagonal and the genetic distance is below diagona

2.4.3聚類分析 聚類分析是以數學方法為基礎，描述群體間關系的一種具體而形象的分析手段，在微衛星多態性分析中常用等位基因頻率進行聚類分析[12]。試驗常用Nei提出的遺傳距離進行聚類分析，因為它在繪制系統發生樹的精確性上要優于其他聚類方法。本實驗采用MEGA6.0軟件對Nei遺傳距離進行UPGMA聚類分析，聚類結果見圖2。

由圖2可知，5份敏鹽材料始終聚為一大類，說明它們具有較近的親緣關系，也間接的證明了它們具有相近的耐鹽特性，均表現為敏鹽。耐鹽材料中“巨能”和“巨能7號”始終聚為一類，說明它們的親緣關系較近，這可能與它們擁有共同的親本有關；“阿迪娜”和“抗旱”又聚為一類，這可能是因為“阿迪娜”和“抗旱15”的遺傳背景中有部分的共同點，有較近的親緣關系。

圖2 10份紫花苜蓿材料9個微衛星標記的UPGMA系統發生樹Fig.2 The UPGMA dendrogram of 9 microsatellite markers in 10 alfalfa

3 討論

我國擁有較為豐富的苜蓿屬植物資源，研究其遺傳多樣性可以保存利用遺傳資源。在本次試驗中：10份紫花苜蓿品種中平均多態位點百分率為47.1%～71.8%，所測結果與畢玉芬[10]所測的多態位點百分率接近，說明10份苜蓿材料具有比較豐富的基因變異；平均雜合度為0.759～0.828，所測結果與張阿英[12]所測的平均雜合度接近，說明10份苜蓿材料在微衛星座位為雜合子的比例高；10個品種的PIC為0.735～0.811，均大于0.7屬于中高度多態，在遺傳連鎖分析中，PIC大于0.7的微衛星DNA為最理想的選擇標記[10]；平均有效等位基因觀察數與等位基因觀察數的比為0.680～0.890與劉志鵬[11]所測的結果相近，反映出在群體中起作用的等位基因的比例；香農指數為1.753～1.976，表明SSR位點的不定性大。綜上所述，這10份耐鹽、敏鹽苜蓿材料具有較高的選擇潛能。

遺傳分化系數(Gst)是衡量群體間在多個座位上遺傳分化的指標，是品種間基因分化相對量的一個較好的測度[12]。利用RFLP和RAPD標記技術研究表明苜蓿具有非常強的雜合性，在品種內的差異性大于品種間的差異性[19]。畢玉芬等[10]通過分析北疆苜蓿屬植物間的遺傳結構得出：導致種群間遺傳變異加大的主要原因是不同種水平上的遺傳差異。本研究的10份紫花苜蓿材料各品種內平均雜合度為0.799，總群體的平均雜合度為0.887，遺傳分化系數為0.100。說明這10份紫花苜蓿材料的遺傳變異主要發生在各群體內部。這與畢玉芬測得基因分化系數0.103一致。

本研究依據Nei提出的一個從大量座位的基因頻率數據估算個座位的平均密碼子差數的統計方法[20]，計算出10份紫花苜蓿材料間的Nei遺傳距離，并采用MEGA6.0軟件的UPGMA聚類方法進行聚類分析結果表明：在閾值0.093處5份敏鹽材料聚為一類，說明他們具有較近的親緣關系。這可能與它們具有相似的耐鹽特性有關也間接證明耐鹽性評價結果的準確性；在閾值0.098處阿迪娜和抗旱15又聚為一亞類，這可能是因為阿迪娜和抗旱15的遺傳背景中有部分的共同點；在閾值0.082處耐鹽材料中的巨能和巨能7號始終聚為一亞類，說明它們的親緣關系較近，這可能與它們擁有共同的親本有關，也間接證明實驗數據及算法的可靠性。

紫花苜蓿因為具有同源四倍體，異花授粉等遺傳特性，使得其遺傳背景復雜[11]。在本研究中，每個品種隨機取樣50份，樣本量總體偏少，不能完全覆蓋品種內的多態位點信息。同時在耐鹽與敏鹽品種的平均多態信息含量的比對中并沒有顯著差異，意味著這些SSR位點可能與紫花苜蓿其它性狀相關，后續將進行SSR標記的表型關聯分析。通過利用SSR分子標記技術對紫花苜蓿材料的微衛星位點的多態性分析，可快速、即時了解其遺傳多樣性，而確定優良育種材料的遺傳背景是苜蓿育種工作的基礎[21]。

4 結論

利用IBM SPSS Statistics 19軟件進行綜合評價，根據綜合評價值(D值)對10個紫花苜蓿品種內的遺傳變異程度大小排序，排列順序為：“巨能”>“騎士T”>“巨能7號”> “Asi”>“興平”>“阿迪娜”>“秘魯”>“抗旱15”>“草原3號”>“國產苜蓿”；利用MEGA6.0軟件對Nei遺傳距離進行UPGMA聚類分析可知：5份敏鹽材料始終聚為一類；“巨能”與“巨能7號”聚為一類；“阿迪娜”和“抗旱15”又聚為一類，說明他們之間有較近的親緣關系。