日本結(jié)縷草衰老葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建及酵母單雜交篩選驗(yàn)證

滕 珂， 檀鵬輝， 范希峰， 岳躍森， 姜紅巖， 武菊英*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心， 北京 100097; 2. 北京林業(yè)大學(xué)，草業(yè)與草原學(xué)院， 北京 100083)

植物cDNA文庫(kù)是植物在特定發(fā)育時(shí)期或特定生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA片段與文庫(kù)載體連接而成的克隆的集合[1]。自從1976年HOFSTETTER構(gòu)建了首個(gè)cDNA文庫(kù)以來(lái)，cDNA文庫(kù)的應(yīng)用越發(fā)廣泛，構(gòu)建技術(shù)亦經(jīng)歷了多次升級(jí)[2]。經(jīng)典cDNA文庫(kù)受到克隆片段長(zhǎng)度的限制，存在一定的天然缺陷[1]。全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)可提供完整的mRNA信息，并且可以用來(lái)研究mRNA可變性剪切信息[3]。均一化cDNA文庫(kù)，可增加獲取低豐度mRNA的概率[4]。構(gòu)建cDNA文庫(kù)不僅可以保存瀕危物種的基因資源，也可以用于批量克隆基因而進(jìn)行基因功能研究[3]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)基因上下游調(diào)控機(jī)制的研究已越發(fā)受到青睞。因此，獲得一個(gè)高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)成為深入研究基因功能及其調(diào)控機(jī)制的重要基礎(chǔ)。

酵母單雜交系統(tǒng)是在酵母雙雜交基礎(chǔ)上衍生而來(lái)的，主要用來(lái)研究DNA與蛋白質(zhì)的互作[5-6]。酵母單雜交的主要原理基于DNA結(jié)合域與轉(zhuǎn)錄激活域相互獨(dú)立，將獵物蛋白融合到含有GAL4轉(zhuǎn)錄激活域的載體中，然后用誘餌序列調(diào)取獵物蛋白激活下游報(bào)告基因，從而達(dá)到篩選或驗(yàn)證的目的[7]。酵母單雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于借助酵母體內(nèi)表達(dá)，保證轉(zhuǎn)錄因子蛋白的自然結(jié)構(gòu)，可更真實(shí)的模擬真核蛋白的表達(dá)模式[8]。目前，應(yīng)用較為廣泛的酵母單雜交系統(tǒng)主要有pHIS2系統(tǒng)和pAbAi系統(tǒng)；前者不需要對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行線(xiàn)性化進(jìn)而整合到酵母基因組，具有操作方便的優(yōu)點(diǎn),而后者采用金擔(dān)子素A(Aureobasidin A，AbA)作為篩選標(biāo)記，具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。但是，單純的酵母單雜交篩選無(wú)法完全避免假陽(yáng)性的存在，需要結(jié)合雙熒光素酶(Dual-luciferase)分析和凝膠遷移(Electrophoretic mobility shift assays，EMSA)等手段進(jìn)一步驗(yàn)證互作的真實(shí)性。

日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)是一種重要的暖季型草坪草，因其耐踐踏、抗旱性強(qiáng)、耐鹽等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪的建植及城市綠化[9-11]。然而，較短的綠期成為制約結(jié)縷草在我國(guó)北方地區(qū)進(jìn)一步推廣應(yīng)用的重要因素[12-13]。因此，從分子水平上揭示日本結(jié)縷草葉綠素降解的調(diào)控機(jī)制顯得十分必要，可為延長(zhǎng)綠期和延緩衰老提供理論依據(jù)。脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶(Pheophytin pheophorbide hydrolase,PPH)專(zhuān)一地催化脫鎂葉綠素a脫植醇生成脫鎂葉綠酸a，是調(diào)控葉綠素降解的一個(gè)關(guān)鍵酶[14]。但目前，有關(guān)PPH的上游調(diào)控機(jī)制仍不是十分清楚，在結(jié)縷草上更是如此。本研究旨在構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的日本結(jié)縷草衰老葉片的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，并利用酵母單雜交技術(shù)篩選ZjPPH1基因的上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，以期為更好地探索日本結(jié)縷草的葉綠素降解和衰老途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用的植物材料為日本結(jié)縷草‘Meyer’品種，其幼苗放置于人工氣候箱(RXZ-380D-LED，寧波江南儀器)中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為28℃/25℃(晝/夜)，濕度65%，光照16 h·d-1，光強(qiáng)600 μmol·m-2·s-1，種植基質(zhì)為草炭，蛭石和珍珠巖(2∶1∶1)混合基質(zhì)，培養(yǎng)8個(gè)月。

RNA提取試劑盒購(gòu)于OMEGA公司(美國(guó))。cDNA構(gòu)建試劑盒、亮氨酸缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Leu)、色氨酸缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Trp)、亮氨酸-色氨酸缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Leu-Trp)、色氨酸-組氨酸缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Trp-His)、亮氨酸-色氨酸-組氨酸缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Leu-Trp-His)等這些酵母缺陷型培養(yǎng)基購(gòu)自Clontech公司(美國(guó))。感受態(tài)細(xì)胞HST08、限制性?xún)?nèi)切酶SfiI購(gòu)于TaKaRa公司(日本)。酵母單雜交系統(tǒng)為BD公司(美國(guó))(www.bdbiosciences.com)的pHIS2系統(tǒng)，3-AT (3-AMINO-1,2,4-TRIAZOLE)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(德國(guó))。所用的電轉(zhuǎn)儀為BIO-RAD公司(美國(guó))的E.coli pulser。

1.2 方法

1.2.1總RNA的提取及全長(zhǎng)cDNA的合成 選取健康生長(zhǎng)的日本結(jié)縷草自然衰老的葉片，稱(chēng)取0.1 g，液氮中全部研磨，用試劑盒提取總RNA，得到的RNA用DNase I處理。用Nano Drop 2000C分析提取的RNA的OD 260/280和OD 260/230的比值，之后經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格的RNA用于后續(xù)試驗(yàn)。首先，取1 μg RNA使用Clontech公司的SMART cDNA Library Construction Kit合成第一鏈cDNA；然后利用Advantage HF 2 PCR Kit (Clontech公司)取2 μL第一鏈cDNA進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增，合成雙鏈cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA合成效果。

1.2.2cDNA短片段去除 使用限制性?xún)?nèi)切酶SfiI對(duì)cDNA進(jìn)行酶切處理，然后使用CHROMA SPIN-1000-TE對(duì)酶切后cDNA進(jìn)行過(guò)柱處理，去除短片段。經(jīng)PCI/CI凈化處理后，用無(wú)水乙醇精制，最后用dd H2O 溶出。取1 μL cDNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)短片段去除效果。

1.2.3初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒的獲得 使用DNA ligation Kit將pGADT7載體與適量過(guò)柱后的cDNA在12℃條件下過(guò)夜連接，將獲得的連接液進(jìn)行純化精制，得到20 μL初級(jí)cDNA文庫(kù)。取0.5 μL初級(jí)文庫(kù)連接液，利用BIO-RAD公司的 E.coli pulser電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)化HST08感受態(tài)細(xì)胞(電轉(zhuǎn)條件為：1.8 KV，200 Ω，25 μF)。取10 μL轉(zhuǎn)化液涂布氨芐(Ampicillin，Amp)抗性的LB平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)平板生長(zhǎng)菌落的個(gè)數(shù)，按照文庫(kù)滴度(cfu·mL-1)=單菌落數(shù)量×稀釋倍數(shù)/涂板體積(mL)公式計(jì)算初級(jí)文庫(kù)的滴度。隨機(jī)挑取16個(gè)單菌落，使用通用引物pGADT7-F (5′-GGAGTACCCATACGACGTACC-3′)和pGADT7-R(5′-TATCTACGATTCATCTGCAGC-3′)進(jìn)行插入片段檢測(cè)。

1.2.4初級(jí)cDNA文庫(kù)百萬(wàn)級(jí)擴(kuò)增及質(zhì)粒提取 根據(jù)初級(jí)文庫(kù)的庫(kù)容大小，取初級(jí)文庫(kù)大于100萬(wàn)克隆的量，計(jì)算需要的連接液的體積，電轉(zhuǎn)化至HST08感受態(tài)細(xì)胞中，涂布10個(gè)Amp抗性的LB大平板(24.5 cm×24.5 cm)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)實(shí)際轉(zhuǎn)化獲得的擴(kuò)增克隆數(shù)量。回收擴(kuò)增菌落，用Nucleo Bond Xtra Midi EF試劑盒(Clontech公司)進(jìn)行質(zhì)粒提取，取100 ng擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)粒進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5酵母單雜交篩選cDNA文庫(kù) 將前期試驗(yàn)克隆得到的ZjPPH1基因啟動(dòng)子的327 bp的序列通過(guò)同源重組的方法克隆到pHIS2載體中，獲得pHIS2-ZjPPH1pro重組載體。為確定能夠抑制HIS3表達(dá)背景的最低3-AT濃度，首先將pHIS2-ZjPPH1pro質(zhì)粒通過(guò)LiAc的方法[15]轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，之后用0.9%的NaCl溶液將鑒定為陽(yáng)性克隆的菌液OD值調(diào)到0. 2左右，然后取10 μL菌液稀釋1，10，100倍，分別點(diǎn)在含有0，50，60，80，100，150 mmol·L-13-AT的SD/-Trp-His平板上，30℃下培養(yǎng)48 h。監(jiān)測(cè)酵母的生長(zhǎng)情況，然后確定最低3-AT的濃度。

在確定好3-AT濃度之后，利用共轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行酵母單雜交篩選。試驗(yàn)設(shè)置正對(duì)照為：pGAD-Rec2-53+p53HIS2；負(fù)對(duì)照為：pGAD-Rec2-53+pHIS2。取10 μLcDNA文庫(kù)質(zhì)粒(1 μg·μL-1)和5 μg pHIS2-ZjPPH1pro質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)化600 μL的Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞。用0.9%的NaCl溶液將轉(zhuǎn)化后的Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞稀釋到OD值約0.2。分別取100 μL 1/10、1/100和1/1000轉(zhuǎn)化后的酵母感受態(tài)細(xì)胞涂布于SD/-Leu，SD/-Trp和SD/-Leu-Trp的培養(yǎng)基上，以此監(jiān)控轉(zhuǎn)化效率。剩下500 μL酵母感受態(tài)涂布于10個(gè)含有最適3-AT的SD/-Leu-Trp-His培養(yǎng)基平板上，30℃下培養(yǎng)48 h。挑取能夠正常生長(zhǎng)的酵母單菌落，分別劃線(xiàn)至新的含有適量3-AT的SD/-Leu-Trp-His培養(yǎng)基上，能夠正常生長(zhǎng)的即視為互作蛋白。最后，利用通用引物pGADT7-F和pGADT7-R進(jìn)行菌落PCR，經(jīng)測(cè)序后確定候選基因。

1.2.6候選基因的生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN 8.0對(duì)PCR測(cè)序結(jié)果進(jìn)行去載體片段處理，確定候選蛋白核苷酸序列。確定序列之后，制作FASTA格式文件，利用百邁客的云平臺(tái)小工具(https://console.biocloud.net)進(jìn)行Nr(NCBI non-redundant protein database)，KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)，Cog(Cluster of orthologous genes)，SwissProt (A manually annotated,non-redundant protein database)，Kog(euKaryotic orthologous groups)等注釋?zhuān)@得候選基因的生物信息學(xué)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

利用Nano Drop 2000C檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度，結(jié)果顯示OD260/280=2.07，OD260/230=2.13，RNA質(zhì)量合格。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳再次檢測(cè)RNA的質(zhì)量，結(jié)果顯示，18S和28S兩條帶清晰可見(jiàn)(圖1)，RNA質(zhì)量可滿(mǎn)足建庫(kù)要求。

圖1 RNA質(zhì)量檢測(cè)Fig.1 Quality verification of the RNA

2.2 全長(zhǎng)cDNA合成

取5 μL cDNA進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)合成效果。結(jié)果顯示，獲得的cDNA長(zhǎng)度分布在250～4 500 bp區(qū)間內(nèi)(圖2)，表明已獲得質(zhì)量合格的cDNA，可用于下一步試驗(yàn)。

圖2 全長(zhǎng)ds cDNA檢測(cè)Fig.2 Quality examination of the full length ds cDNA

2.3 短片段去除

用SfiI對(duì)上一步所獲得的cDNA進(jìn)行酶切處理后，利用CHROMA SPIN-1000-TE進(jìn)行過(guò)柱處理，去除短片段。經(jīng)PCI/CI凈化處理后，取1 μLcDNA進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，小于500 bp的小cDNA片段和未使用完的引物、引物二聚體等得到有效去除，可用于下一步的連接轉(zhuǎn)化(圖3)。

圖3 短片段去除檢測(cè)Fig.3 Purifying of the ds cDNA

2.4 載體連接及初級(jí)文庫(kù)滴度檢測(cè)

經(jīng)計(jì)算，該研究所獲cDNA初級(jí)文庫(kù)的庫(kù)容約2.0×106cfu·mL-1。隨機(jī)挑取16個(gè)單克隆，利用引物pGADT7-F和pGADT7-R進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示，插入片段的長(zhǎng)度分布范圍為500～3 000 bp，平均長(zhǎng)度大于1 000 bp。16個(gè)克隆均可擴(kuò)增出高亮條帶，重組率為100%(圖4)。

圖4 插入片段檢測(cè)Fig.4 Determination of the inserted cDNA segments注：1～16表示不同插入片段Note:1～16 representing different insert segments

2.5 初級(jí)cDNA文庫(kù)百萬(wàn)級(jí)擴(kuò)增及質(zhì)粒提取

取初級(jí)文庫(kù)約130萬(wàn)克隆的量電轉(zhuǎn)化HST08感受態(tài)細(xì)胞，涂布10個(gè)24.5 cm×24.5 cm的LB平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)檢測(cè)實(shí)際轉(zhuǎn)化獲得的擴(kuò)增克隆數(shù)量。回收擴(kuò)增菌落，使用NucleoBond Xtra Midi EF試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取后，共獲得擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)粒約5 mg。取100 ng擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)粒進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，文庫(kù)質(zhì)粒大小符合預(yù)期(圖5)。該研究獲得擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)粒充足，可滿(mǎn)足后續(xù)酵母單雜交等試驗(yàn)需求。

2.6 pHIS2-ZjPPH1pro質(zhì)粒最低3-AT濃度篩選

為確定能夠抑制HIS3表達(dá)背景的最低3-AT濃度，首先將pHIS2-ZjPPH1pro質(zhì)粒通過(guò)LiAc的方法轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞。用0.9%的NaCl水溶液將確定為陽(yáng)性克隆的菌液OD調(diào)至0. 2左右，然后取10 μL梯度稀釋?zhuān)謩e點(diǎn)在含有0，50，60，80，100，150 mmol·L-13-AT的SD/-Trp-His的平板上。30℃培養(yǎng)48 h后的結(jié)果如圖6所示，在低濃度3-AT背景下，均發(fā)現(xiàn)有不同程度的酵母克隆生長(zhǎng)；而在150 mmol·L-1的3-AT背景下，酵母生長(zhǎng)明顯受到抑制，表明150 mmol·L-1的3-AT濃度可以有效抑制背景HIS3的表達(dá)，該濃度可用于下一步的酵母單雜交篩庫(kù)。

圖5 文庫(kù)質(zhì)粒檢測(cè)Fig.5 Examination of the constructed cDNA library plasmid

2.7 酵母單雜交篩選候選基因

本研究采取共轉(zhuǎn)化的方法將10 μL文庫(kù)質(zhì)粒(1 μg·μL-1)和5 μg pHIS2-ZjPPH1pro質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化600 μL準(zhǔn)備好的Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞。在含有150 mmol·L-13-AT的SD/-Leu-Trp-His平板上培養(yǎng)3 d后，檢測(cè)酵母的生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照幾乎長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)平板，而陰性對(duì)照未發(fā)現(xiàn)有菌落長(zhǎng)出。觀(guān)察試驗(yàn)組的情況，發(fā)現(xiàn)有零星的單菌落分布。挑取48個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果顯示，42個(gè)菌落可擴(kuò)增出條帶，其中有34個(gè)菌落可擴(kuò)增出單一條帶。另外8個(gè)含有多個(gè)條帶，應(yīng)該是轉(zhuǎn)入了多個(gè)質(zhì)粒所致，為酵母單雜交過(guò)程中的正常現(xiàn)象。然后挑選20個(gè)條帶較亮的PCR產(chǎn)物送測(cè)序，分析候選基因。

圖6 酵母單雜交最適3-AT濃度篩選Fig.6 Screening of the optimal concentration of 3-ATused for yeast one-hybrid screening

圖7 酵母單雜交篩選Fig.7 Screening of yeast one-hybrid

2.8 候選基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 8.0 去除PCR產(chǎn)物測(cè)序的載體序列片段后，利用百邁客云平臺(tái)的基因功能注釋功能對(duì)測(cè)序得到的20個(gè)候選基因序列進(jìn)行注釋?zhuān)Y(jié)果表明，20個(gè)候選基因均可注釋到序列信息。Nr同源物種注釋結(jié)果表明，20個(gè)注釋到的基因中可比對(duì)到粟(Setariaitalica)的最多有7個(gè)，其次是玉米(Zeamays)和粳稻(OryzasativaJaponica Group)各3個(gè)。GO注釋結(jié)果表明，這些基因可分為細(xì)胞組分、分子功能和生化過(guò)程3大類(lèi)。在細(xì)胞過(guò)程、單一組織進(jìn)程和代謝過(guò)程所含的基因數(shù)量最多。KEGG注釋結(jié)果顯示，這些候選基因富集到了糖酵解、檸檬酸循環(huán)、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸合成、丙酮酸代謝路和丁酸甲酯代謝等通路。

圖8 候選克隆的PCR檢測(cè)Fig.8 PCR verification of the candidate clones注：1～48表示不同候選基因Note:1～48 representing different candidate genes

表1 候選基因的生物信息學(xué)分析Table 1 Bioinformatics analysis of candidate genes

NCBI登錄號(hào)NCBI accession number候選蛋白Candidate protein比對(duì)物種Aligned speciesGO注釋GO annotationMK283737假定蛋白Hypothetical protein 稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)—MK283738線(xiàn)粒體丙酮酸載體Mitochondrial pyruvate carrier 二穗短柄草(Brachypodium distachyon)GO:0005743MK283739丙酮酸脫氫酶E1成分亞單位Beta 3 pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta-3 短花藥野生稻(Oryza brachyantha)GO:0004739MK283741未知功能蛋白Uncharacterized protein 粟(Setaria italica)GO:0009941MK283742假定蛋白Hypothetical protein高粱(Sorghum bicolor)GO:0003677MK283743假定蛋白Hypothetical protein高粱(Sorghum bicolor)GO:0005840MK28374440S核糖體蛋白 40S ribosomal protein S14 粳稻(Oryza sativa Japonica Group)GO:0003735MK283740核定位序列結(jié)合蛋白Nuclear localization sequence-binding protein 粟(Setaria italica)GO:0000166MK283745重金屬相關(guān)的異戊基植物蛋白Heavy metal-associated isoprenylated plant protein 粟(Setaria italica)GO:0000302MK283746依賴(lài)于A(yíng)TP的鋅金屬蛋白酶ATP-dependent zinc metalloprotease 粟(Setaria italica)GO:0004222MK283747未知功能蛋白Uncharacterized protein粟(Setaria italica)GO:0005739MK283748假定蛋白Hypothetical protein石藻(Emiliania huxleyi)GO:0043231MG870086未知功能蛋白Uncharacterized protein 玉米(Zea mays)—MK283749SPX含蛋白結(jié)構(gòu)域SPX domain-containing protein 粟(Setaria italica)GO:0005634MK283750未知功能蛋白Uncharacterized protein 玉米(Zea mays)—MK283751假定蛋白Hypothetical protein 玉米(Zea mays)GO:0016023MK283752假定蛋白Hypothetical protein 油菜(Brassica napus)GO:0005840MH428376NAC蛋白NAC superfamily protein粳稻(Oryza sativa Japonica Group)GO:0003677MH479420AP2/ERF蛋白AP2/ERF superfamily protein粟(Setaria italica)GO:0009693MK286467SOC1蛋白SOC1 protein粳稻(Oryza sativa Japonica Group)GO:0004739

3 討論

構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)是利用酵母系統(tǒng)進(jìn)行單雜、雙雜篩選互作蛋白的基礎(chǔ)。坪觀(guān)質(zhì)量很大程度上決定了草坪草的市場(chǎng)價(jià)值，因此，衰老一直是草坪草研究的一個(gè)重要方向。本研究開(kāi)展之前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)構(gòu)建日本結(jié)縷草衰老葉片cDNA文庫(kù)的報(bào)道，而該cDNA文庫(kù)的構(gòu)建對(duì)揭示日本結(jié)縷草葉片衰老進(jìn)程和葉綠素降解途徑的研究十分重要。衡量一個(gè)cDNA文庫(kù)的質(zhì)量，滴度、重組率和插入片段的大小是主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)[16]。一般cDNA文庫(kù)的滴度要求不少于1.0×106cfu·mL-1 [17]。cDNA插入片段的大小以及重組率是另外兩個(gè)影響文庫(kù)質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)，植物cDNA長(zhǎng)度一般大于或者等于1 kb，文庫(kù)平均插入片段過(guò)小會(huì)影響文庫(kù)質(zhì)量，而過(guò)度篩除cDNA片段則會(huì)造成初始文庫(kù)的滴度過(guò)低，丟失部分基因信息[16]。本研究利用SMRT cDNA合成技術(shù)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)滴度約2.0×106cfu·mL-1，插入片段平均長(zhǎng)度大于1 kb，cDNA片段插入重組率為100%，表明該文庫(kù)的完整性很高，可涵蓋絕大多數(shù)基因信息，并且達(dá)到了高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，可滿(mǎn)足后續(xù)酵母單雜交篩選的要求。

酵母單雜交技術(shù)是篩選與基因啟動(dòng)子特異結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的有效手段，也可以用于鑒定與DNA互作的蛋白。Chen等[18]利用酵母單雜交技術(shù)研究了擬南芥PPH基因的上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，并證實(shí)SOC1轉(zhuǎn)錄因子可直接結(jié)合PPH的CArG-box來(lái)調(diào)控葉綠素降解。Wang等[19]利用酵母單雜交篩選，發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果MYB22可結(jié)合UFGT和FLS基因啟動(dòng)子的MYBCORE元件來(lái)影響黃酮醇的合成。Ma等[20]通過(guò)酵母單雜交揭示了番茄SlNAP2通過(guò)結(jié)合SlSAG113，SlSGR1和SlPAO的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)葉片衰老。本研究利用pHIS2酵母單雜交系統(tǒng)，篩選到50余個(gè)可與日本結(jié)縷草ZjPPH1啟動(dòng)子結(jié)合的候選菌落，為研究ZjPPH1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了基礎(chǔ)。

生物信息學(xué)分析表明，隨機(jī)挑選測(cè)序的20個(gè)候選基因都可以在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得注釋。注釋到的20個(gè)候選基因比對(duì)到粟(Setariaitalica)的最多。盡管結(jié)縷草基因組已公布(http://zoysia.kazusa.or.jp./)，但此次分析結(jié)果顯示并未比對(duì)到結(jié)縷草相關(guān)基因，這可能是由于此版本的Nr數(shù)據(jù)庫(kù)不含結(jié)縷草的數(shù)據(jù)導(dǎo)致。根據(jù)已有研究報(bào)道并結(jié)合ZjPPH1啟動(dòng)子序列作用元件分析，本試驗(yàn)初步確定了NAC，AP2/ERF，SOC1，HGRP，CCH蛋白和40S核糖體合成蛋白作為后期試驗(yàn)的候選基因。前期利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be)網(wǎng)站分析，在ZjPPH1的啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)CGT[G/A]，CArG作用元件，它們分別是NAC，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子潛在的結(jié)合位點(diǎn)。此外，HGRP蛋白主要在維持細(xì)胞壁韌性和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)中起作用[21]。CCH蛋白主要分布于衰老葉片的維管束和葉柄中，可調(diào)控銅元素在衰老組織和繁殖器官之間的轉(zhuǎn)運(yùn)[22]。40S核糖體合成蛋白在細(xì)胞增殖中可起到非常重要的作用，其功能的缺失可嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長(zhǎng)周期[23]。這些蛋白在日本結(jié)縷草葉片衰老和葉綠素降解中的作用和結(jié)合的作用元件仍不清楚，需要進(jìn)一步的雙熒光素酶系統(tǒng)和EMSA等試驗(yàn)的驗(yàn)證。GO注釋結(jié)果顯示，這些候選基因可能主要參與了細(xì)胞過(guò)程、單一組織進(jìn)程和代謝等生物過(guò)程。KEGG注釋結(jié)果表明，這些候選基因在糖酵解、檸檬酸循環(huán)、纈氨酸等通路中起調(diào)控作用。這些生物信息學(xué)分析結(jié)果為進(jìn)一步挖掘候選基因提供了參考。

4 結(jié)論

本研究率先利用SMRT cDNA合成技術(shù)構(gòu)建了日本結(jié)縷草衰老葉片的cDNA文庫(kù)，其滴度為2.0×106cfu·mL-1，插入片段平均長(zhǎng)度大于1 kb，cDNA片段插入重組率為100%。該文庫(kù)的完整性較高，可涵蓋絕大多數(shù)基因信息，為酵母單雜交篩選奠定了基礎(chǔ)。

利用酵母單雜交技術(shù)，篩選到可與ZjPPH1基因啟動(dòng)子結(jié)合的候選基因42個(gè)，并對(duì)20個(gè)候選基因進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析，初步篩選到6個(gè)參與細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老過(guò)程的重要候選基因。為進(jìn)一步探索ZjPPH1基因在日本結(jié)縷草衰老和葉綠素降解中的上游調(diào)控機(jī)制提供了理論支撐。