苜蓿SKU5基因的表達調控及其在秋眠中的作用

杜紅旗, 徐照學, 房衛平, 馮長松*, 婁治國, 袁華祎

(1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所， 河南 鄭州， 450008； 2.河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室， 河南 鄭州， 450008；3.河南省農業科學院經濟作物研究所， 河南 鄭州， 450008)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上廣泛種植和利用的多年生優良豆科牧草，在其栽培和品種選育中考慮的首要指標是秋眠性。秋眠性是指夏末秋季由于日照長度縮短和溫度下降，紫花苜蓿植株表現為緩慢匍匐生長或停止生長的一種特性。根據苜蓿秋眠特定時期刈割后植株的再生高度，將其分為秋眠型苜蓿(秋眠1-3級)、半秋眠型苜蓿(秋眠4-6級)和非秋眠型苜蓿(秋眠7-9級)[1-2]，后來又擴展到 11 個秋眠級別(10-11 級)，包括 2個極不秋眠苜蓿[3]。秋季時秋眠型苜蓿品種生長緩慢、葉小和莖纖細，但具有較強的抗寒性和高的越冬率；相反，非秋眠型苜蓿依然生長旺盛，但抗寒性差[4-5]；半秋眠型苜蓿介于2者之間。

目前，國內外普遍認為調控紫花苜蓿秋眠性的主要環境因子是光周期和溫度[6-7]，其中光周期是誘導苜蓿秋眠的關鍵因子[8]。國外對不同季節不同秋眠類型苜蓿根系的生長狀態、根系和根頸可溶性糖的積累，以及根和芽氮素化合物的分解代謝進行了大量研究[9-13]，并且2000年Douglas等人確定了控制秋眠型苜蓿秋季生長的基因組區域，但是該區域具體的核苷酸序列未知[14]。國內對苜蓿品種的遺傳多樣性、秋眠性與抗寒性關系、秋眠性與生產性能的關系等方面進行了較多的研究[15-17]，認為光敏色素、隱花色素2B、脫落酸，生長素等可能參與秋眠性的調控[18-20]。王成章、杜紅旗等應用高通量測序技術得到了大量的調控苜蓿秋眠的候選基因、蛋白和microRNAs，并且選出了重要候選調控基因和蛋白[21-24]。但是這些僅僅停留在調控秋眠性候選基因和蛋白的篩選階段，并未真正確定調控苜蓿秋眠性的基因。

前期應用轉錄組測序篩選調控苜蓿秋眠性關鍵基因時發現單銅氧化酶樣蛋白SKU5基因(SKU5)在秋眠型苜蓿Maverick葉片中秋眠時期的表達量顯著高于未秋眠時的表達量[23]，因此推測它可能調控苜蓿的秋眠性。單銅氧化酶樣蛋白SKU5屬于植物多銅氧化酶亞家族成員SKS蛋白，SKS家族蛋白是植物多銅氧化酶基因家族中存在的一類特別的亞家族,均屬于定位在細胞質膜上的糖基化蛋白。它們只包含多銅氧化酶中保守的T2Cu連接位點而缺乏其他類型銅離子連接所需的組氨酸殘基，其可能已經不具備正常的多銅氧化酶功能，而是以一種新的方式作用于植物生長發育，但是這一領域的認識幾乎是空白，目前唯一確定的是，這種變異并不是偶然的，對于植物機體來說，這種新型的多銅氧化酶一定有著不可取代的生理功能，這些都需要更加深入探索[25]。目前，在擬南芥中發現了SKS蛋白家族單銅氧化酶樣蛋白SKU5和SKS1-SKS18共19個成員，在油菜、煙草、玉米、報春花等植物中也發現了該類蛋白。SKS家族基因編碼的蛋白質在植物根生長方向、葉脈形式、花粉發育、花粉管伸長、激素調節等生物學過程中均具有作用，但是整個SKS基因家族的研究只集中在少數基因上[26-31]。

Sedbrook等最先從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中得到了SKS家族成員基因SKU5。SKU5全長為3.3Kb，包含9個外顯子，開放閱讀框長1 764 bp，預期編碼一個定位在細胞質膜和細胞壁上的大小為66kDa的糖蛋白，其結構類似于多銅氧化酶中的AAO和漆酶。雖然單銅氧化酶樣蛋白SKU5與這2種酶相似，但是它缺乏T1Cu和T3Cu所需的組氨酸殘基。SKU5在擬南芥各組織中均有表達，而在根尖分生組織和末梢伸長組織中表達量最大。SKU5過表達植株在瓊脂糖上生長時，根和下胚軸與野生型相比較短15%，根偏離了正常的向下生長，并且與黃化的下胚軸都顯示出逆時針的軸向旋轉，打亂了根系的正常向下生長[27]。但是目前苜蓿SKU5的研究未見報道。

本研究通過檢測春夏秋季和人工條件下不同光照時間或溫度下秋眠型苜蓿品種Maverick和非秋眠型苜蓿品種Cuf101葉片中SKU5 mRNA相對表達量及分析其與苜蓿株高、葉面積、日照長度、溫度的相關性來研究它在苜蓿秋眠中的作用。本研究為闡明苜蓿秋眠性分子機理提供了新的內容、豐富了苜蓿秋眠性理論，也為苜蓿分子育種提供功能基因。

1 材料與方法

1.1 樣品采集、株高和葉面積檢測并記錄日照長度和溫度

試驗材料為美國苜蓿標準秋眠1級品種Maverick和秋眠9級品種Cuf101。2011年4月份到10月份期間測株高、葉面積，記錄日照長度、溫度并取樣。具體操作是：每次刈割后第14天上午8:00采集各品種至少三株苜蓿植株的葉片，取每個分枝頂端第一個成熟葉片以下的第3—5片成熟葉片，取后立刻保存在液氮中，之后存于-80℃冰箱待用，同時記錄每個月的日照長度和溫度。每一苜蓿品種隨機選取5株，每株隨機選取10片葉片測長和寬，應用A=KLW (A：葉面積leave area；K：修正系數coefficient of correction；L：葉長Leave length；W：葉寬leave wide)公式計算葉面積[32]。每次取樣時每一苜蓿品種隨機選取15株，每株測高、中、低枝條高度取平均值作為該苜蓿株的株高。

Maverick和Cuf101苜蓿在人工氣候箱中不同光照時間或不同溫度下培養處理。每種苜蓿各3組，每組各3株苜蓿植株，分別在每天8 h，12 h和16 h的光照時間培養，溫度均為24℃、光照強度均為3 000 lux。每種苜蓿另外各3組，每組各3株苜蓿植株，分別在16℃,24℃和 32℃下培養，光照強度均為3 000 lux、每天光照時間均為16 h。每種處理均是刈割后開始處理，處理14d后取各自的葉片并儲存于-80℃冰箱待用。

1.2 總RNA提取與反轉錄

嚴格按照TRizol法提取總RNA的操作步驟提取各樣品的總RNA(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，應用Nano2000核酸檢測儀器(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)檢測各樣品RNA的濃度，并調至同一濃度，嚴格按照TAKARA公司反轉錄試劑盒的說明書上操作步驟對各樣品的總RNA反轉錄。

1.3 各樣品中SKU5 mRNA相對表達量檢測

前期轉錄組測序得到的SKU5部分序列在NCBI數據庫中序列比對進行基因注釋、保守序列分析和各外顯子界限的分析，根據序列分析結果和紫花苜蓿GAPDH基因序列應用primer5.0軟件按照熒光定量引物設計原則設計SKU5和GAPDH的熒光定量引物(SKU5-S：GGAACACCAAGAGGAGAAGCA，SKU5-A：TTTTCATCCTCAACATTGCTCTG；GAPDH-S：TGGGAAGCACATTACAGCAG，GAPDH-A：CATCAGCATTGACACCAACC)，在羅氏Cycler9.0熒光PCR儀上應用羅氏SYBER green熒光染料檢測各樣品中SKU5mRNA相對表達量。

1.4 統計學分析

采用2-ΔΔCt公式計算SKU5mRNA相對表達量，用平均值±標準差表示[33]。應用SPSS 19.0(IBM Corp.,USA)軟件對所測數據進行統計學分析。應用one-way ANOVA方法分析各樣品間SKU5 mRNA相對表達量的差異顯著性，并應用雙因子相關性分析和雙邊T檢驗方法分析SKU5 mRNA相對表達量、日照長度、溫度、株高和葉面積之間的相關性。最后，應用GraphPad prism 5 (GraphPad Software,Inc.,USA)軟件對各數據進行線型圖的制作。

2 結果與分析

2.1 采樣時期日照長度和溫度

從4月份至10月份，日照長度和溫度的變化趨勢均先升高后降低。從4月份至6月份的夏至，日照長度逐漸延長，其中夏至日最長；從6月份夏至日始至10月份，日照長度逐漸縮短；從4月份至10月份，溫度先升高后逐漸下降，其中7月份最高(圖1)。

圖1 4—10月份的日照長度和平均溫度Fig.1 Daylength and average temperature from April to October

2.2 采樣時2種苜蓿株高和葉面積

5月份至10月份，Maverick品種的株高逐漸下降，4—8月份Maverick苜蓿株高兩兩差異不顯著，9，10月份株高極顯著低于4—8月份的株高(P< 0.01)，表明Maverick品種苜蓿在秋季發生秋眠；Cuf101株高4—10月份之間差異不顯著，但6—9月份株高有下降的趨勢，7—10月份Cuf101苜蓿株高兩兩月份之間差異不顯著；但是Cuf101苜蓿的株高顯著高于對應月份Maverick苜蓿的株高(P<0.05)，表明Cuf101苜蓿在秋季不發生秋眠(圖2)。

Maverick苜蓿葉面積小于Cuf101苜蓿葉面積。8，9和10月份Maverick苜蓿葉面積極顯著小于Cuf101苜蓿葉面積(P< 0.01)；8，9和10月份Maverick苜蓿葉面積顯著小于其它時期葉面積(P<0.05)；Cuf101苜蓿葉面積各月份之間差異不顯著,表明秋季Maverick苜蓿秋眠時的葉面積顯著變小(圖3)。

2.3 SKU5基因mRNA相對表達量

2.3.1自然條件下SKU5基因mRNA相對表達量 自然條件下，從4月份至10月份秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5 mRNA相對表達量呈先升高后降低的趨勢；非秋眠型苜蓿Cuf101葉中SKU5 mRNA相對表達量呈升高、降低、升高、降低的趨勢；秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5 mRNA相對表達量在9月份最高，秋季時的相對表達量顯著高于春夏季時的相對表達量(P<0.05)；非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5 mRNA相對表達量在8月份最高，之后SKU5 mRNA相對表達量急劇降低(圖4)。結果表明：秋季時2種苜蓿葉中SKU5 mRNA相對表達量變化存在差異；秋眠型苜蓿Maverick葉中SKU5 mRNA相對表達量在秋眠時期的量高于未秋眠時期的量和秋季時非秋眠型Cuf101葉片中的量。

圖2 4—10月份2種苜蓿株高Fig.2 Plant height of Maverick and Cuf101 varieties from April to October注：**代表Maverick苜蓿9，10月份株高極顯著低于4月份時的株高(P < 0.01)；#代表7，8月份Maverick苜蓿株高顯著低于Cuf101株高(P< 0.05)，##代表9，10月份Maverick苜蓿株高極顯著低于Cuf101株高(P < 0.01)Note:** indicates that plant height of Maverick at September and October is very significant lower than that at April at the 0.01 level;# indicates that plant height of Maverick is significant lower than that of Cuf101 at July and August at the 0.05 level;## indicates that plant height of Maverick is very significant lower than that of Cuf101 at September and October at the 0.01 level

圖3 兩品種苜蓿4—10月份葉面積Fig.3 Leaf area of Maverick and Cuf101 varieties from April to October注：##代表8、9、10月份Maverick苜蓿葉面積極顯著小于8，9，10月份Cuf101的葉面積(P<0.01)，**代表9、10月份Maverick苜蓿葉面積極顯著小于其4-7月份時的葉面積(P<0.01)，*代表8月份 Maverick苜蓿葉面積顯著小于其4-7月份時的葉面積(P<0.05)Note: ## indicates that leaf area of Maverick is very significant smaller than that of Cuf101 at August, September and October at the 0.01 level, ** indicates that leaf area of Maverick at September and October is very significant smaller than that at April to July at the 0.01 level, * indicates that leaf area of Maverick at August is significant smaller than that at April to July at the 0.05 level

2.3.2人工氣候條件下SKU5基因mRNA相對表達量 人工氣候條件下，隨著日照長度延長，2種苜蓿葉片中SKU5 mRNA相對表達量逐漸減少,其中8h日照長度時的量顯著高于12h和16h時的量(P< 0.05)；秋眠型苜蓿品種Maverick葉片中的量極顯著高于非秋眠型苜蓿品種Cuf101葉片中的量(P< 0.01)(圖5)。

圖4 4—10月份2種苜蓿葉中SKU5 mRNA相對表達量Fig.4 mRNA relative abundance of SKU5 in Maverick and Cuf101 varieties from April to October注：**代表7,8,9,10月份時的SKU5 mRNA相對表達量極顯著高于4月份時的相對表達量Note:** indicate that SKU5 mRNA relative abundance in two varieties alfalfa at July,August,September,October is very significant more than that at April at the 0.01 level

圖5 不同日照長度下兩品種苜蓿真葉中SKU5mRNA相對表達量Fig.5 mRNA relative abundance of SKU5 in Maverick and Cuf101 varieties grown under 8h to 16h daylength and artificial growth conditions注：* 代表8 h下每一品種苜蓿葉片SKU5 mRNA相對表達量顯著高于12 h和16 h下的相對表達量；##代表Maverick苜蓿SKU5 mRNA相對表達量極顯著高于Cuf101苜蓿中的相對表達量Note:* indicates that the mRNA relative abundance of SKU5 in Maverick and Cuf101 varieties under 8 h illumination is significant more than that 12 h,and 16 h of illumination at the 0.05 level;## indicate that the mRNA relative abundance of SKU5 in Maverick leaves is very significant more than that in Cuf101 leaves at the 0.01 level

隨著溫度的升高，苜蓿葉片中SKU5 mRNA相對表達量逐漸增加,其中16℃時的量極顯著低于24℃和32℃時的量(P< 0.01),Maverick葉片中的量極顯著高于Cuf101葉片中的量(P< 0.01)(圖6)。結果表明：人工氣候條件下，秋眠型苜蓿Maverick和非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5的表達受光周期和溫度的調控規律一致，但是2種苜蓿品種葉片中SKU5基因的轉錄受日照長度和溫度調控趨勢相反。

圖6 人工條件下不同溫度處理的兩品種苜蓿葉中SKU5 mRNA相對表達量Fig.6 mRNA abundance of SKU5 in Maverick and Cuf101 varieties grown under artificial growth conditions at different temperatures (from 16℃ to32℃)注：** 代表16℃下每一品種苜蓿葉片SKU5 mRNA相對表達量極顯著低于24℃和32℃下的相對表達量；##代表Maverick苜蓿SKU5 mRNA相對表達量極顯著高于Cuf101苜蓿中的相對表達量Note:** indicate that the mRNA relative abundance of SKU5 in both varieties at 16℃ is very significant less than that 24℃and 32℃at the 0.01 level;## indicate that the mRNA relative abundance of SKU5 in Maverick leaves isvery significant more than that in Cuf101 leaves at 16℃,24℃ and 32℃ at the 0.01 level

2.4 SKU5mRNA相對表達量、苜蓿葉面積、株高、日照長度、溫度之間的相關性

自然條件下,SKU5 mRNA相對表達量與日照長度、溫度沒有顯著相關性(表1)；但是在人工氣候條件下,SKU5 mRNA相對表達量與日照長度極顯著負相關、與溫度極顯著正相關；日照長度和溫度對SKU5表達的調控趨勢相反(表2)。

表1 自然條件下SKU5 mRNA相對表達量與日照長度、溫度相關性Table 1 Correlation between SKU5 mRNA relative abundance in the leaves of two varieties and daylength,temperature under natural environment

表2 人工條件下SKU5 mRNA相對表達量與日照長度、溫度相關性Table 2 Correlation between SKU5 mRNA relative abundance in the leaves of two varieties and daylength,temperature under artificial growth conditions

注：** 代表差異極顯著(P<0.01)

Note:** indicate significant correlation at the 0.01 level

自然條件下，日照長度、溫度與2種苜蓿株高無顯著相關性，但日照長度與2種苜蓿株高相關性更高，與秋眠型苜蓿Maverick株高的相關性和顯著性高于與非秋眠型苜蓿Cuf101的相關性和顯著性(表3)。

表3 日照長度、溫度與2種苜蓿株高相關性Table 3 Correlation between daylength,temperature and the plant height of two varieties

自然條件下，秋眠型苜蓿Maverick葉中SKU5 mRNA相對表達量與葉面積、株高呈顯著負相關；而非秋眠型苜蓿Cuf101葉中的相對表達量與葉面積、株高無顯著相關(表4)。

表4 SKU5 mRNA相對表達量與株高、葉面積相關性Table 4 Correlation between SKU5 mRNA relative abundance in the leaves of two varieties and plant height,leaf area

注：* 代表差異顯著(P<0.05)

Note:* indicates significant correlation at the 0.05 level

以上結果表明：在日照長度與溫度共同作用的自然條件下，隨著秋眠型苜蓿Maverick葉片中的SKU5基因可能通過上調其表達抑制葉片和植株的生長；非秋眠型苜蓿Cuf101SKU5基因影響其葉片和植株的生長不顯著。

3 討論

不同秋眠型苜蓿在不同季節生長表現差異，特別是在秋季生長表現顯著差異并用秋眠的程度來衡量，但是目前苜蓿秋眠的發生機理不清楚。本研究表明：秋眠型苜蓿Maverick和非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的表達受日照長度極顯著負調控、受溫度極顯著正調控，但自然條件下，秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5基因的表達主要受日照長度的調控，非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的表達主要受溫度的調控；秋眠型苜蓿MaverickSKU5基因的高表達減小其葉面積、降低其株高從而促進其秋眠，而非秋眠型苜蓿Cuf101SKU5基因的表達高低對其葉面積和株高變化的影響不明顯。

3.1 兩種秋眠型苜蓿葉片中SKU5基因的表達受日照長度和溫度調控能力不同

在人工條件下2種秋眠型苜蓿SKU5基因的表達受日照長度和溫度調控的趨勢均相反，日照長度負調控SKU5基因的表達(表1)，日照長度的縮短促進SKU5基因的表達、溫度的降低減少其表達；在自然條件下該基因的表達是受日照長度和溫度雙因子共同作用的結果，因此得不到自然條件下SKU5基因的表達受日照長度和溫度的調控(圖4)。對于秋眠型苜蓿Maverick，從6月份開始隨著日照長度的縮短SKU5基因的相對表達量增加，從7月份起溫度的降低并未改變SKU5基因表達增加的趨勢，因此秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5基因的表達主要受日照長度的調控。從非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的表達整體上看，高溫時非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的相對表達量高于低溫時的相對表達量，隨著溫度的降低其相對表達量減少，但從8月份，隨著日照長度的縮短非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的相對表達量并未增加，因此非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的表達主要受溫度的調控。秋眠型苜蓿最初引自寒冷氣候地區、具有很好的抗寒性，適合于寒冷氣候的地區生長；而非秋眠型苜蓿引自冬季溫度溫和的地區，適合于熱帶地區生長；它們形成了各自獨有適應環境的調控方式[1]，并且秋眠型苜蓿與非秋眠型苜蓿的遺傳背景和遺傳多樣性不同[34-35]。因此，由于環境因子的變化，各自調控基因表達的調控機理和結果表現出大的差異，這可能就是導致本研究中兩種秋眠型苜蓿葉片中SKU5基因的表達受日照長度和溫度調控能力不同的原因。

在自然條件下，4—10月份2種苜蓿SKU5基因的表達趨勢基本一致，但也有差別，最大的差別是秋季時二者SKU5基因mRNA相對表達量變化不一致，秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5基因mRNA相對表達量在9月份達到最高，10月份緩慢減少，而非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因mRNA相對表達量在8月份達到最高，9，10月份迅速降低(圖4)，在這個時期秋眠型苜蓿發生秋眠，非秋眠型苜蓿不發生秋眠。因此我們推測：2種苜蓿中SKU5基因表達的差異在秋季它們生長表現差異中起著重要的作用，在秋季它的高表達促進了秋眠型苜蓿的秋眠、低表達維持了非秋眠型苜蓿的正常生長。SKU5基因的過表達擬南芥相對于野生型植株其根和下胚軸變短[27],此結果與本研究的結果相似。

3.2 SKU5基因調控苜蓿秋眠性機理

葉面積是苜蓿秋眠性的一個重要指標[21，36]。它是葉片細胞周期、分裂和生長的宏觀表現,細胞周期調節與整個器官生長速率的變化有著直接的聯系,細胞周期、分裂和生長受細胞和環境因素之間空間關系的調節[37-38]，葉片大小受細胞周期、分裂和生長相關基因表達變異的影響[39]，有研究表明單銅氧化酶樣蛋白SKU5與細胞周期、分裂和生長均有關[27]。

日照長度是調控苜蓿秋眠性的關鍵環境因子[16-17]，從夏季至秋季隨著日照長度的縮短秋眠型苜蓿發生秋眠。本研究表明SKU5基因的表達受日照長度和溫度的調控，其中秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5基因的表達主要受日照長度的調控，日照長度的縮短導致秋眠型苜蓿葉片中SKU5基因的表達量升高(圖4)，而且秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5基因mRNA的相對表達量與其葉面積和株高顯著負相關，SKU5基因的高表達減少了葉面積、降低了株高(圖2-4，表4)，秋季時秋眠型苜蓿發生秋眠。因此，隨著日照長度的縮短，SKU5基因的高表達很可能促進了秋眠型苜蓿的秋眠。

眾所周知,葉的光合作用、呼吸作用和蒸騰作用對植物的生長發育起著重要的作用。銅是蛋白質的重要輔助因子，參與呼吸代謝中的氧化還原反應，葉綠體質體藍素中銅參與光合作用的電子傳遞過程[40]，所以銅含量的減少會降低葉片光合作用效率。單銅氧化酶樣蛋白SKU5基因的高表達會與葉綠體質體藍素競爭銅而導致葉綠體質體藍素能結合的銅相對減少從而降低光合作用，進而抑制了植物的生長。另外，有研究表明：單銅氧化酶樣蛋白SKU5可能通過參與細胞壁的膨脹來參與2個方向的定向生長過程[27]。因此，SKU5調控秋眠型苜蓿秋眠的機理可能是隨著日照長度的縮短導致了它的高表達從而降低了細胞壁的膨脹,抑制了葉片2個方向的生長而導致了葉片變小和變薄，以及降低了葉綠體質體藍素結合的銅，最終共同減弱了葉片光合作用、呼吸作用和蒸騰作用，從而減慢了整個植株的生長而發生秋眠。

4 結論

苜蓿葉片中SKU5基因的表達受日照長度和溫度的調控，但是2種秋眠型苜蓿葉片中SKU5基因的表達受日照長度和溫度的調控方式不同；對于秋眠型苜蓿，隨著日照長度的縮短SKU5高表達參與調控苜蓿的秋眠。