低溫脅迫對不同早熟禾品種糖酵解代謝及其相關基因表達的影響

董文科， 馬 祥， 張玉娟， 郭 睿， 張兆恒， 張 巖， 馬暉玲*

(1. 甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅省草業工程實驗室， 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2. 青藏高原優良牧草種質資源利用重點實驗室， 青海省畜牧獸醫科學院， 青海 西寧 810016)

低溫脅迫是一種常見的環境脅迫因子，是影響植物生長發育和地理分布最主要的因素之一[1]。植物在受到低溫脅迫時，其細胞膜系統遭到損傷，礦質營養吸收受到影響，生物合成速率降低，光能吸收減少，許多生理代謝功能受阻，嚴重時可導致植株死亡[2-3]。草地早熟禾(Poapratensis)是優良的禾本科牧草，也是城市草坪建植中主要使用的冷季型草坪草，廣泛用于草坪建設以及生態環境治理[4]。但低溫是影響草地早熟禾綠期和越冬的主要環境因素，若冬季溫度較低或春秋季受寒流侵襲，會出現無法越冬、春季返青慢和秋季早衰等現象，嚴重影響草坪的美觀[5]。青海扁莖早熟禾(Poapratensisvar.ancepscv. Qinghai)是草地早熟禾的一個變種，是青藏高原分布最廣的優質牧草之一，其抗寒、耐旱，抗逆性強，在零下35℃的低溫下能安全越冬，適合在海拔3 000 m以上、年降雨量400 mm的高寒牧區種植[6]。青海扁莖早熟禾葉量多、草質柔嫩、營養豐富、適口性好，是家畜的優良飼草；其根系強壯發達、易形成草皮、固土能力強，在青藏高原高寒地區生態環境治理、水土保持中也發揮著重要作用[7]。目前，對于青海扁莖早熟禾低溫應答機制的研究大多集中在生理生化方面，而植物對低溫等逆境脅迫的調節和適應是一個綜合的反應，涉及基因調節、轉錄后調節、翻譯后修飾和代謝物反饋等多個生物學水平的系統調節。因此，更為深入的探究青海扁莖早熟禾對低溫脅迫的響應機制，可以為后續的抗寒基因挖掘和草坪草分子育種工作提供有力支持。

糖是植物光合作用的主要產物，也是呼吸作用的底物，它為植物細胞的構建和耗能提供碳骨架和能源，同時具有調控代謝、抵抗環境脅迫和影響生長發育等重要作用[8]。糖類的代謝是生物體代謝的中心，它連通了核酸代謝、蛋白質代謝、脂類代謝及次生代謝等多個代謝途徑[9]。其中，糖酵解途徑是糖類代謝的一個重要過程，在高等植物中的主要作用是氧化蔗糖產生ATP、NADH和丙酮酸[10]。該途徑與植物響應溫度、干旱和鹽堿等非生物脅迫相關[11]。在非生物脅迫下，植物體內的果糖通過糖酵解途徑分解為丙酮酸時需要多種酶催化，這些酶不僅起到催化反應和能量調節器的作用，而且還能作為信號傳導裝置響應環境變化[12]。本實驗室前期將抗寒性強的青海扁莖早熟禾和對低溫敏感的商用草地早熟禾‘巴潤’(Poapratensis′Baron′)進行低溫處理后用轉錄組學的方法分析了這兩種早熟禾品種對低溫脅迫的分子響應機制，并對這兩個品種特有的差異表達基因進行富集分析發現，青海扁莖早熟禾在糖酵解/糖異生途徑富集較多，而草地早熟禾‘巴潤’在此途徑無差異表達基因富集。因此，本研究繼續以草地早熟禾‘巴潤’作為對照，對青海扁莖早熟禾糖酵解途徑相關物質及調控基因與其抗寒性的關系進行初步研究，旨在揭示青海扁莖早熟禾抗寒性與糖酵解途徑的關系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料青海扁莖早熟禾(PQ)由青海省畜牧獸醫科學院提供；商用品種草地早熟禾‘巴潤’(PB)由北京克勞沃草業技術開發中心提供。

1.2 材料培養與處理

本試驗于2018年9-11月在甘肅農業大學草業學院培養室中進行，選取顆粒飽滿、健康的早熟禾種子，經20% NaClO消毒后，均勻播種在直徑25 cm、高20 cm的育苗缽中，基質為營養土和蛭石的混合物(2:1)。在人工培養箱內培養，晝夜溫度為(25±1)℃；時長為白天16 h，夜晚8 h；光照強度為500 μmol·(m2·s)-1；相對濕度60%～70%。待幼苗長至10 cm左右時進行間苗，每盆留下長勢一致的30株幼苗進行下一步試驗。

待幼苗長出4～5片真葉時進行低溫處理。將每個材料長勢一致的幼苗放置在0℃的低溫光照培養箱中進行低溫處理(除溫度外其他培養條件同處理前)，采集低溫脅迫處理0 h，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h，72 h和 120 h后的葉片樣品，用于生理指標和基因相對表達量的測定。試驗設置3次生物學重復，同時設常溫對照(25±1)℃。

1.3 測定指標及方法

細胞膜傷害率=[(ET-ECK)/(100-ECK)]×100%

式中，ET為低溫處理下樣品的相對電導率，ECK為常溫對照樣品的相對電導率。

1.3.2糖含量測定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法[13]測定；蔗糖和果糖含量參照劉麗杰[15]的方法測定。

1.3.3丙酮酸含量測定 丙酮酸(Pyruvic acid,Pyr)的提取和測定參照孟德義[12]的方法。

1.3.4己糖激酶活性測定 己糖激酶(Hexokinase,HxK)粗酶液的提取和測定參照Schaffer等[16]的方法。

1.3.5磷酸果糖激酶活性測定 磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase,PFK)粗酶液的提取和測定參照Mustroph[17]的方法。

1.3.6丙酮酸激酶活性測定 丙酮酸激酶(Pyruvatekinase,PK)粗酶液的提取和測定參照孟德義[12]的方法。

1.3.7總RNA的提取及糖酵解關鍵酶調控基因表達分析 采用TIANGEN公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取葉片總RNA，采用Solarbio公司的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄成cDNA。以反轉錄的cDNA為模板，肌動蛋白基因Actin為內參[18]，用LightCycler 96實時熒光定量PCR儀進行實時熒光定量分析，試驗設置3個重復。肌動蛋白基因(PpActin)、己糖激酶基因(PpHxK)、磷酸果糖激酶基因(PpPFK)和丙酮酸激酶基因(PpPK)的引物序列根據NCBI的同源序列進行比對，用Premier 6.0設計基因特異性引物(表1)。實時熒光定量PCR反應體系為20 μL，采用兩步法擴增，反應條件為94℃預變性5 min,然后95℃變性15 s，60℃退火30 s，40個循環。用2-ΔΔCt法[19]計算各基因的相對表達量。

當選取合適的反應級數n時,對lnk*與1/T進行線性擬合,由直線的斜率和截距即可得到樣品動力學參數E和A,實現動力學求解。

表1 qRT-PCR引物序列信息Table 1 Primer sequence information of qRT-PCR

1.4 數據分析

SPSS 20.0軟件進行統計分析，采用單因素ANOVA進行分析處理，Duncan’s新復極差法進行顯著性方差分析；采用Microsoft Excel 2010進行繪圖與數據處理。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對相對電導率和細胞膜傷害率的影響

如圖1A所示，隨著低溫脅迫的持續，PQ和PB的相對電導率不斷上升，其中PB的相對電導率呈直線上升趨勢，在脅迫120 h時較常溫對照提高了3.53倍；PQ的相對電導率在整個低溫脅迫時期均顯著低于PB (P<0.05)，且呈先上升后趨于平緩最后再上升的趨勢，在120 h時與常溫對照相比，僅提高了1.39倍。低溫脅迫下，PQ和PB細胞膜傷害率的變化趨勢和相對電導率相似(圖1B)，在120 h時PQ的細胞膜傷害率最大為28.02%，而PB最大為73.95%，是PQ的2.64倍。

2.2 低溫脅迫對糖及丙酮酸含量的影響

2.2.1對可溶性糖含量的影響 如圖2A所示，隨著低溫脅迫的持續，PQ和PB的可溶性糖含量均呈先上升后下降的趨勢。PB在脅迫12 h時可溶性糖含量達到最大，較PB常溫對照處理提高了0.44倍，12 h后逐漸降低；而PQ的可溶性糖含量在48 h時達到最大，較PQ常溫對照處理提高了1.86倍，此后呈降低趨勢，但整體維持在一個較高水平。總體來看，在整個低溫處理過程中，PQ的可溶性糖含量均顯著高于PB (P<0.05)。

2.2.2對蔗糖含量的影響 如圖2B所示，低溫脅迫下，PQ的蔗糖含量呈持續上升趨勢，在72 h時達到最大，較PQ常溫對照處理提高了2.29倍，隨后呈下降趨勢，但下降幅度較小；PB的蔗糖含量在低溫脅迫下0～6 h時雖有提高，但提高幅度較小；6 h后PB的蔗糖含量顯著提高(P<0.05)，在24 h時達到最大值，較PB常溫對照處理提高了51.68%，隨后雖在72 h時有小幅度上升，但整體呈下降趨勢。同時，PB的蔗糖含量在整個低溫脅迫時期均顯著低于PQ (P<0.05)。

圖1 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片相對電導率和細胞膜傷害率的影響Fig. 1 Effects of low temperature stress on relative conductivity and cell membrane injury rate of two bluegrass leaves注：同一脅迫時間下不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同Note：Different lowercase letters in same stress time indicate significant difference at 0.05 level. The same as below

2.2.3對果糖含量的影響 如圖2C所示，低溫脅迫下0 ～ 6 h時，PQ的果糖含量雖有上升，但上升幅度較小；6 h后PQ的果糖含量顯著提高(P<0.05)，并隨著低溫脅迫的持續呈上升趨勢，在72 h時達到最大值，較PQ常溫對照處理提高了68.61%，隨后呈下降趨勢；PB的果糖含量隨著低溫脅迫的持續雖有所上升，但整體變化趨于平緩，在48 h時達到最大值，但僅較PB常溫對照處理提高了8.38%。在整個低溫處理過程中，PQ的果糖含量均顯著高于PB (P<0.05)。

2.2.4對蔗糖和果糖總和占可溶性糖比例的影響 對PQ和PB在低溫脅迫下蔗糖和果糖總和占可溶性糖比例進行分析發現(圖2D)，低溫脅迫下0 ～ 3 h，PQ的蔗糖和果糖總和占可溶性糖比例呈下降趨勢，3 h后呈上升趨勢，并在12 h時達到第一個峰值，隨后呈先降后升再降的趨勢，在72 h時達到最大比例，為57.49%，較PQ常溫對照的比例提高了25.83%；低溫脅迫下，PB的蔗糖和果糖總和占可溶性糖比例在0 ～ 6 h時呈下降趨勢，在6 h時達到最低，并顯著低于PB常溫對照(P<0.05)；在6 ～ 24 h時呈上升趨勢，24～48 h又下降，48 h后又呈上升趨勢。總體來看，PB的蔗糖和果糖總和占可溶性糖的平均比例低于常溫對照，也低于PQ。

圖2 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片糖含量的影響Fig.2 Effects of low temperature stress on sugar content of two bluegrass leaves

2.2.5對丙酮酸含量的影響 如圖3所示，低溫脅迫下0 ～ 6 h時，PQ的丙酮酸含量雖有上升但幅度較小，6 h后迅速上升，并在72 h時達到最大值，較PQ常溫對照處理提高了46.43%，而在120 h時丙酮酸含量呈迅速下降趨勢；與PQ相似，PB的丙酮酸含量在低溫脅迫下0 ～ 6 h時雖有上升但幅度較小，隨后上升幅度較大，在24 h時達到峰值，但僅較PB常溫對照處理提高了9.99%，此后呈下降趨勢。在整個低溫處理過程中，除0 ～ 1 h時PB的丙酮酸含量略高于PQ外，其余時間下均顯著低于PQ (P<0.05)。

圖3 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片丙酮酸含量的影響Fig. 3 Effects of low temperature stress on pyruvic acid content of two bluegrass leaves

2.3 低溫脅迫對糖酵解途徑關鍵酶活性的影響

2.3.1對己糖激酶活性的影響 由圖4A可知，低溫脅迫下0 ～ 1 h時，PQ的己糖激酶活性迅速升高，并在3 h時達到第一個峰值，在3 ～ 6 h時又呈下降趨勢，6 h后又迅速升高，并在48 h時達最大值，較PQ常溫對照處理提高了48.98%，此后呈下降趨勢，但整體維持在一個較高水平；PB的己糖激酶活性隨脅迫時間的延長呈先升后降的趨勢，也在48 h時達最大值，較PB常溫對照處理提高了13.26%。總體來看，PQ的己糖激酶活性在整個脅迫過程中均顯著高于PB (P<0.05)。

2.3.2對磷酸果糖激酶活性的影響 由圖4B可知，PQ的磷酸果糖激酶活性在低溫脅迫下1 h內迅速上升，并隨脅迫時間的延長持續上升，在120 h時達到最大值，此時較PQ常溫對照處理提高了58.74%；PB的磷酸果糖激酶活性在0 ～ 12 h時呈上升趨勢，并在12 h時達到最大，較PB常溫對照處理提高了15.22%，此后隨在72 h時有小幅上升，但整體呈下降趨勢。在整個低溫處理過程中，除0 h時PB的磷酸果糖激酶活性顯著高于PQ (P<0.05)外，其余均顯著低于PQ (P<0.05)。

2.3.3對丙酮酸激酶活性的影響 由圖4C可知，PQ的丙酮酸激酶活性在低溫脅迫下0 ～ 3 h時雖有上升，但上升幅度較小，3 h后顯著升高，并在48 h時達最大值，較PQ常溫對照處理提高了1.63倍，隨后呈逐漸下降趨勢；PB的丙酮酸激酶活性在低溫脅迫下0 ～ 1 h時呈下降趨勢，隨后呈先升后降的趨勢，在24 h時達到最大值，此時較PB常溫對照處理提高了56.52 %，此后在72 h時迅速下降，并且其活性顯著低于PQ常溫對照(P<0.05)。同時，PB的丙酮酸激酶活性在整個低溫脅迫時期均顯著低于PQ (P<0.05)。

2.4 低溫脅迫對糖酵解途徑關鍵酶調控基因表達的影響

2.4.1對PpHxK表達變化的影響 由圖5A可知，PQ的PpHxK相對表達量在低溫脅迫處理0 ～ 1 h時迅速上調，到達第一個峰值，1 ～ 3 h時呈下降趨勢，3 h時后又呈上調趨勢，在6 ～ 12 h時迅速上調，至48 h時達到第二個峰值，此時PQ的PpHxK相對表達量較常溫對照上調了2.53倍，此后呈逐漸下降趨勢，72 ～ 120 h時降幅較大；PB的PpHxK相對表達量在低溫脅迫下0 ～ 3 h時呈上升趨勢，3 ～ 6 h小幅下降，6 h后總體呈上升趨勢，在72 h時表達量最高，此時PB的PpHxK相對表達量僅較PB常溫對照提高了0.17倍。總體來看，PQ的PpHxK相對表達量在整個脅迫過程中均顯著高于PB (P<0.05)。

2.4.2對PpPFK表達變化的影響 由圖5B可知，PQ的PpPFK相對表達量在低溫脅迫開始時迅速上升，在3 h時到達第一個峰值，此時PpPFK相對表達量較常溫對照上調了1.85倍；3 ～ 6 h時有小幅度下降，6 h后又呈上升趨勢，在24 h時達到第二個峰值，此時PpPFK相對表達量較常溫對照上調了2.47倍；72 h時達到第三個峰值，PpPFK相對表達量較常溫對照上調了2.43倍，此后呈下降趨勢；PQ的PpPFK相對表達量隨脅迫的持續，呈先上升后下降的趨勢，在6 h時達最大值，僅較PB常溫對照上調了0.81倍，在120 h時達到最低，并顯著低于PB常溫對照(P<0.05)。而PQ的PpPFK相對表達量在整個脅迫過程中均顯著高于PB (P<0.05)。

2.4.3對PpPK表達變化的影響 由圖5C可知，隨著低溫脅迫的持續，PQ的PpPK相對表達量呈先上升后下降的趨勢，在24 h時達到最大，此時PpPK相對表達量較PQ常溫對照上調了2.06倍；PB的PpPK相對表達量隨脅迫的持續呈先上升后下降再上升的趨勢，在48 h時達最大，其相對表達量較PB常溫對照僅上調了0.58倍。與PpHxK和PpPFK的相對表達量相似，PQ的PpPK相對表達量在整個脅迫過程中均顯著高于PB (P<0.05)。

圖4 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片糖酵解途徑關鍵酶活性的影響Fig.4 Effects of low temperature stress on the activities of key enzymes in glycolysis pathway of two bluegrass leaves

圖5 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片糖酵解途徑關鍵酶編碼基因表達的影響Fig.5 Effects of low temperature stress on the gene expression of key enzymes in glycolysis pathway of two bluegrass leaves

3 討論

低溫脅迫下，植物體內可溶性碳水化合物的含量增加，在一定程度上可以緩解低溫對植物細胞的損傷。可溶性碳水化合物積累提高植物抗寒性的三個主要原因：一是通過糖類物質的代謝與積累提高植物滲透調節能力，保持低溫脅迫下體內良好的水分狀況；二是糖類物質能夠有效保護生物膜及生物大分子物質的結構和活性；三是糖類物質的代謝與積累可以產生能源并為其他保護性物質提供合成基礎[20]。在這些碳水化合物中可溶性糖含量與植物抗寒性關系最為密切，通常可溶性糖的積累可以提高植物的抗寒性[21]。本研究中，低溫脅迫均會引起PQ(青海扁莖早熟禾)和PB(草地早熟禾‘巴潤’)可溶性糖含量的升高，但PQ在整個脅迫過程中的含量以及較常溫對照的上升幅度均高于PB，這也與PQ表現較強的抗寒性有直接關系。王淑杰等[22]對不同抗寒性的葡萄(Vitisvinifera)品種進行分析發現，抗寒性強的葡萄品種其可溶性糖含量均高于抗寒性弱的品種，但不同品種的可溶性糖含量隨溫度的降低均有上升，只是上升幅度存在差異，這與本研究結果相似。植物體內可溶性糖種類較多，不同種類的可溶性糖都可以參與調節生物膜系統的穩定性，但不同品種的植物在低溫脅迫下積累的可溶性糖種類也存在較大差異，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)在低溫脅迫下積累較多的為棉子糖[23]；小麥(Triticumaestivum)和黑麥(Secalecereale)幼苗中的蔗糖和果糖含量在低溫脅迫下會迅速升高[24-25]；而水稻(Oryzasativa)中阿拉伯糖、蔗糖和果糖含量會得到顯著積累[26]。在本研究中，PQ和PB在低溫脅迫開始時蔗糖含量就有顯著升高，并且PQ的上升幅度顯著高于PB，說明在整個脅迫過程中蔗糖的積累主要影響這兩種早熟禾的抗寒性；而對于果糖，在低溫脅迫初期，PQ中的含量上升幅度較小，直至后期才顯著升高；在PB中的含量雖隨低溫脅迫的持續有所上升，但整體變化趨于平緩，說明果糖積累對PQ抗寒性的影響主要體現在后期，但對于PB的影響小于蔗糖。

糖酵解途徑是呼吸代謝和糖分分解的一個重要過程，植物在逆境條件下需要消耗大量的能量來提高抗性，而能量主要在糖酵解途徑產生，糖酵解途徑中己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是三種最關鍵的不可逆酶[27]。己糖激酶催化葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖在己糖異構酶的作用下生成6-磷酸果糖，隨后在磷酸果糖激酶作用下生成1,6-二磷酸果糖，最后在丙酮酸激酶作用下使磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸和ATP[28]。研究表明，低溫脅迫下糖酵解途徑中的這三種酶活性變化趨勢在不同植物中并不相同[29]。曹玉芳等[30]研究發現，青檀(Pteroceltistatarinowii)中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶對低溫較為敏感，經冷馴化后這兩種酶活性的提高可以增強青檀對低溫脅迫的適應性。但李霞等[31]研究發現，隨溫度的降低，甜櫻桃(Prunusavium)糖酵解途徑速率呈減低趨勢。此外，Dioxon等[32]對馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖中糖酵解途徑進行研究發現，馬鈴薯塊莖中丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶在低溫貯藏條件下活性均顯著降低，其中磷酸果糖激酶有較高的低溫敏感性。而本研究發現，在低溫初期，PQ的己糖激酶和磷酸果糖激酶活性均顯著升高，而丙酮酸激酶活性在脅迫后期顯著升高，三種酶總體呈先上升后下降的趨勢；與PQ相同，PB的己糖激酶和磷酸果糖激酶活性雖也呈先升后降趨勢，但上升幅度均小于PQ；同時，PB的丙酮酸激酶活性在低溫脅迫初期較為敏感，呈下降趨勢，而后期隨低溫脅迫時間的延長又呈先升后降的趨勢，但其活性總體任低于PQ。糖酵解關鍵酶基因對低溫脅迫的響應存在時間上的特異性，這種響應變化可能是植物對滲透脅迫期和滲透平衡恢復期分段適應的表現。本研究對調控這三種關鍵酶的基因表達情況分析發現，在低溫脅迫下兩種早熟禾的糖酵解關鍵酶基因的相對表達量均有提高，但不同時期表達量不同，而其中PQ中的相對表達量均顯著高于PB，也說明PQ的糖酵解代謝能力強于PB。

4 結論

本研究表明，低溫脅迫可以導致青海扁莖早熟禾和草地早熟禾‘巴潤’葉片相對電導率和細胞膜傷害率的增加，但青海扁莖早熟禾的細胞膜損傷程度顯著低于草地早熟禾‘巴潤’。同時，低溫脅迫均可引起兩種早熟禾體內糖類代謝的變化，但整體來看，青海扁莖早熟禾中糖類及丙酮酸含量、糖酵解途徑關鍵酶活性以及糖酵解途徑關鍵酶基因的相對表達量均顯著高于草地早熟禾‘巴潤’。綜上所述，低溫環境下青海扁莖早熟禾能夠有效調控糖酵解代謝途徑來促進糖類及其相關物質的積累與分解，以調節植物因環境因素而引起的滲透勢變化，并為植物體提供能量和次級代謝產物的合成前體。因此，青海扁莖早熟禾體內糖酵解代謝途徑與其耐寒性存在一定關系。