蘇打鹽堿脅迫對兩種苜蓿種子萌發影響及品種耐性綜合分析

賈秀峰

(齊齊哈爾大學教師教育學院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種全球性栽培、適應性廣泛、品質優良的豆科牧草，在干旱和鹽堿環境下生長良好，可以作為綠肥改良土壤，有利于農業生態環境的改善[1]。鹽堿土作為一種土壤類型分布廣泛[2]，全世界的鹽堿土地面積約有9.54×109億hm2，主要集中于歐亞大陸、非洲、美洲西部[2]，我國的鹽堿土地面積為9 913×104hm2，僅以黑龍江省大慶市為例，大慶市地處松嫩蘇打鹽漬區，共有鹽堿化土壤2.87×105hm2,占全市土地總面積的59.4%，該區鹽漬化土壤主要為蘇打鹽堿化土壤，其特點是pH值在8以上，NaHCO3含量高毒性大,是影響區域經濟發展和生態恢復的重要因素[3-4]。堿脅迫比鹽脅迫具有更大的生態破壞力，不僅影響植物的外部形態，也影響植物內部的生理生化特性[5]，造成葉綠素破壞，光合作用率急劇下降[6]，還會使淀粉分解，造成保衛細胞中糖分增多、膨壓增大，最終導致氣孔擴張而大量失水[7]，這些危害都會造成植物死亡。

鹽脅迫最為敏感的時期為種子萌發期，這階段的耐鹽能力在一定程度上反映了植物整體的耐鹽性[5]。目前對植物響應鹽脅迫的研究多以中性鹽(NaCl)為對象，對蘇打土堿性鹽如NaHCO3和Na2CO3的研究往往被忽視[8]。對于東北松嫩平原鹽堿地來說，鹽堿混合脅迫是在實際存在的主要問題，因此,提高鹽漬化土地資源利用率，增加優質蛋白質飼料，可緩解畜牧業飼料短缺，為發展畜牧業奠定物質基礎。本研究對蘇打鹽堿脅迫下紫花苜蓿的種子萌發特征進行研究和綜合分析，為解決苜蓿種子萌發的鹽害問題提供理論依據，既有助于深入了解其萌發的耐鹽堿性，又為苜蓿在鹽堿草地恢復過程提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以2016年收獲的WL343HQ和龍牧807(MedicagosativaL.cv.Longmu No.807)兩種紫花苜蓿種子作為試驗材料，均由黑龍江省畜牧研究所提供。WL343HQ苜蓿粗蛋白含量 15.15%,粗纖維含量 32.43%,粗脂肪含量1.96%，秋眠級為3.9級，該品種產量高，適口性極好，飼用價值高，抗寒和抗病蟲害能力強，適宜在我國山東、山西、河南等地區種植[9]。龍牧807苜蓿粗蛋白含量19.38%,粗纖維含量24.93%,粗脂肪含量1.89%，適口性好，飼用品質優良，其抗寒、耐旱性強，對病蟲害也有一定的抗性,秋眠級為1級，生態適應性廣,適宜在黑龍江省各地及毗鄰省區推廣種植[10]。

1.2 試驗方法

1.2.1種子發芽試驗 挑選籽粒飽滿兩種紫花苜蓿種子100粒，整齊擺放在平鋪充分潤濕的濾紙的發芽盒中，每組重復3次。擺放完畢后稱重，記錄重量以便每天通過補水維持脅迫溶液的種子的濃度。每天觀察并記錄發芽種子的個數。試驗開始并于7 d后結束。隨機選取10株芽苗測量每個芽苗的胚芽長、胚根長及10株芽苗的總鮮重。測量后的芽苗置于濾紙上陰干5 d，在80℃烘干箱烘干至恒重，測量芽苗干重。

1.2.2混合蘇打鹽堿脅迫苜蓿種子 按照NaHCO3∶Na2CO3=9∶1的比例配制蘇打鹽堿溶液(1mmol·L-1蘇打鹽堿含0.9mmol·L-1NaHCO3和0.1 mmol·L-1Na2CO3)，倒入平鋪有濾紙的發芽盒中，使濾紙充分潤濕(約20mL)。蘇打鹽堿脅迫濃度分別為20，25，30，35，40，45，50，55和60 mmol·L-1，對兩種苜蓿種子進行不同濃度蘇打鹽堿脅迫，對照組則使用蒸餾水。試驗結束后按照1.2.1步驟測量芽苗生長的相關指標。

1.2.3測定指標 發芽率(%)= G7/N×100%；

發芽勢(%)=G3/N×100%；

發芽指數(%)(GI)=ΣG7/D7×100%；

活力指數=GI×S。

其中G3表示3 d內的發芽數，G7表示7 d內的發芽數，Dt表示相應的發芽日數，N為種子總數，S表示平均主根長度(mm)。

胚根長為每組發芽盒中10株長勢均勻的萌發芽苗胚根的平均值，胚芽長為每組發芽盒中10株長勢均勻的萌發芽苗胚芽的平均值，鮮重為每組發芽盒中10株長勢均勻的萌發芽苗的總重量，干重每組發芽盒中10株長勢均勻的萌發芽苗烘干后的總重量。

耐鹽極限濃度(%)：以發芽率低于對照發芽率10%時相對應的復鹽濃度為該植物種子耐鹽極限濃度；

耐鹽半致死濃度(%)：以發芽率達對照的一半時相對應的復鹽濃度為該植物種子耐鹽半致死濃度[11]。

1.2.4數據處理與分析 數據用SPSS 19.0和Excel軟件進行統計分析，采用單因素方差分(ANOVA)和新復極差法(Duncan)比較同一品種的不同處理間的差異顯著性，P<0.05時有統計學意義。數值為平均值±標準差。

X(ij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

注：X(ij)表示i種類j指標的隸屬函數值；Xij表示i種類j指標的測定值；Xjmin表示第j個指標最小值；Xjmax表示第j個指標最大值。

2 結果與分析

2.1混合蘇打鹽堿脅迫對苜蓿種子萌發的影響

2.1.1發芽率和發芽勢 WL343HQ和龍牧807苜蓿種子在不同濃度的混合蘇打鹽堿脅迫時，其發芽率和發芽勢的變化見表1。從蘇打鹽堿對兩種苜蓿種子發芽率和發芽勢的影響變化分析，在同一蘇打鹽堿脅迫濃度下，WL343HQ種子的發芽率和發芽勢均高于龍牧807。

兩種苜蓿種子發芽率均隨蘇打鹽堿脅迫濃度的增加呈下降的變化趨勢，其種子發芽率均低于對照組，低蘇打鹽堿濃度對兩種苜蓿種子發芽率下降幅度比較小，WL343HQ和龍牧807苜蓿種子在蘇打鹽堿濃度超過40 和35 mmol·L-1時嚴重影響了其種子的萌發。WL343HQ種子在45，50，55和60 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，發芽率分別比對照組降低了55.72%，77.15%，82.86% 和95.71%，龍牧807種子在40，45和50 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，發芽率分別比對照組降低了58.60%，73.43%和96.87%，蘇打鹽堿脅迫濃度為55和60 mmol·L-1時，種子的發芽率為0，說明此濃度下完全抑制了龍牧807苜蓿種子的萌發。除龍牧807種子在20 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫濃度外，其它蘇打鹽堿濃度下種子的發芽率均與對照差異顯著(P<0.05)。

表1 混合蘇打鹽堿脅迫下苜蓿種子的發芽率和發芽勢Table 1 Germination rate and germination potential of alfalfa seeds under mixed soda salt-alkaline stress

注：同列不同小寫字母表示脅迫濃度間在0.05水平差異顯著;“—”代表在脅迫處理下種子未萌發，下同

Note:Different normal letters in line show significant different among stress concentration at the 0.05 level;“—” indicates no germinate of seedings under stress treatment,the same as below

兩種苜蓿種子發芽勢均隨蘇打鹽堿脅迫濃度的增大呈下降的變化趨勢。WL343HQ苜蓿種子發芽勢除25 mmol·L-1外，其它蘇打鹽堿濃度下發芽勢均低于對照組，低蘇打鹽堿濃度對兩種苜蓿種子發芽勢下降幅度比較小，WL343HQ和龍牧807苜蓿種子在蘇打鹽堿濃度超過40和35 mmol·L-1時嚴重影響了其種子的發芽勢。WL343HQ種子在35，40，45，50，55和60 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，發芽勢分別比對照組降低了51.16%，51.94%，79.85%，93.80%和99.22%，25 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫濃度下，種子發芽勢比對照略有增加，高于40 mmol·L-1蘇打鹽堿濃度嚴重影響了其種子發芽的整齊度。龍牧807種子在35，40和45 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下發芽勢分別比對照組降低了40.20%，69.07%和98.96%，20 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫濃度下，種子發芽勢比對照增加了6.19%。在蘇打鹽堿脅迫濃度為50，55和60 mmol·L-1時，種子的發芽勢為0，說明此濃度下前3 d完全抑制了龍牧807苜蓿種子的萌發。WL343HQ和龍牧807苜蓿種子在蘇打鹽堿濃度超過40 和35 mmol·L-1時，蘇打鹽堿脅迫組與對照組發芽勢比較差異均顯著(P<0.05)。

2.1.2發芽指數和活力指數 兩種苜蓿在蘇打鹽堿脅迫下的發芽指數和活力指數變化見表2，受蘇打鹽堿脅迫苜蓿種子的發芽指數和活力指數均低于對照組，特別是在蘇打鹽堿脅迫濃度為40 mmol·L-1(WL343HQ)和35 mmol·L-1(龍牧807)以上時，兩種苜蓿種子的發芽指數和活力指數均在50%以下，相同濃度下WL343HQ的發芽指數和活力指數均高于龍牧807。

在蘇打鹽堿脅迫下，WL343HQ種子的發芽指數的變化規律不明顯，在脅迫濃度為40mmol·L-1以上時，嚴重影響了苜蓿種子的活力，導致種子的發芽指數顯著下降。40，45，50，55和60 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，其種子的發芽指數分別比對照組降低了55.73%，58.40%，83.16%，92.73%和98.18%。隨著蘇打鹽堿脅迫濃度的增加，龍牧807種子發芽指數逐漸下降，在35，40，45和50 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，分別比對照組降低了51.53%，71.98%，92.56% 和98.97%，55和60 mmol·L-1嚴重影響了苜蓿種子的活力，導致種子的發芽指數為0。除龍牧807種子在20 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫濃度外，其它蘇打鹽堿濃度下種子的發芽指數均與對照差異顯著(P<0.05)。

表2 混合蘇打鹽堿脅迫下苜蓿種子的發芽指數和活力指數Table 2 Germination index and vigor index of alfalfa seeds under mixed soda salt-alkaline stress

隨著蘇打鹽堿脅迫濃度的升高，兩種苜蓿種子活力指數逐漸下降。WL343HQ種子的活力指數在20，25，30，35和40 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下分別比對照組降低了46.91%，57.10%，66.11%，67.54%和93.40%，龍牧807種子的活力指數在25，30，35和40 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下分別比對照組降低了49.08%，53.74%，85.53%和93.39%。45 mmol·L-1以上蘇打鹽堿濃度抑制苜蓿種子萌發，兩種苜蓿種子的脅迫組的發芽指數與對照組比較差異均顯著(P<0.05)。

2.2 混合蘇打鹽堿脅迫對苜蓿種子芽苗生長的影響

2.2.1胚芽長和胚根長 不同濃度蘇打鹽堿脅迫對WL343HQ和龍牧807芽苗胚根長和胚芽長的影響如表3，隨著蘇打鹽堿脅迫濃度的增加，兩種苜蓿種子芽苗的胚芽長和胚根長總體呈下降的趨勢，而脅迫濃度高于45mmol·L-1時，兩種苜蓿的芽苗由于腐爛死亡，導致無法測量其胚芽和胚根長度的變化。在相同蘇打鹽堿濃度脅迫下，WL343HQ的胚芽長和胚根長均長于龍牧807。

蘇打鹽堿在25，30，35和40mmol·L-1脅迫濃度下，WL343HQ芽苗的胚芽長分別比對照組降低了8.49%，10.75%，15.96%和62.67%，龍牧807胚芽長分別比對照組降低了14.47%，17.35%，25.01%和67.60%，當脅迫濃度為20 mmol·L-1時，WL343HQ和龍牧807的胚芽長分別比對照組增加了10.21% 和2.06%。除龍牧807種子在20 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫濃度外，其它蘇打鹽堿濃度下種子的胚芽長均與對照組比較差異顯著(P<0.05)。

蘇打鹽堿脅迫濃度為20，25，30，35和40 mmol·L-1時，WL343HQ芽苗的胚根長分別比對照組降低了44.62%，52.51%，51.50%，58.39%和84.84%，龍牧807芽苗的胚根長分別比對照組降低了16.50%，41.27%，41.22%，74.03%和78.01%。兩種苜蓿芽苗的胚根長脅迫組與對照組比較差異均顯著(P<0.05)。

2.2.2干重和鮮重 不同濃度蘇打鹽堿脅迫對WL343HQ和龍牧807芽苗的干鮮重影響的變化見表4，隨著蘇打鹽堿脅迫濃度的增加，兩種苜蓿種子芽苗的干重和鮮重呈下降的趨勢，而脅迫濃度達到45 mmol·L-1以上時，培養7 d的兩種苜蓿的芽苗均死亡。在相同脅迫濃度下，WL343HQ的芽苗的鮮重和干重均高于龍牧807。

蘇打鹽堿在20，25，30，35和40 mmol·L-1脅迫濃度下，WL343HQ芽苗的鮮重分別比對照組降低了1.36%，5.31%，2.52%，19.66%和37.63%，龍牧807芽苗的鮮重在20，30，35和40 mmol·L-1脅迫濃度下，分別比對照組降低了2.61%，3.51%，28.25%和66.13%，25 mmol·L-1脅迫濃度時比對照組增加了4.28%，其后隨著脅迫濃度增加龍牧807的芽苗鮮重逐漸下降。兩種苜蓿芽苗的鮮重在蘇打鹽堿脅迫濃度為35和40mmol·L-1時，脅迫組與對照組比較差異顯著(P<0.05)。

表3 混合蘇打鹽堿脅迫下苜蓿種子芽苗的胚芽長和胚根長Table 3 Embryo length and radical length of alfalfa seed buds under mixed soda salt-alkaline stress

蘇打鹽堿在20，25，30，35和40mmol·L-1脅迫濃度下，WL343HQ芽苗干重分別比對照組降低了17.80%，27.30%，18.26%，21.81%和57.90%，龍牧807芽苗的干重分別比對照降低了8.65%，3.95%，17.57%，32.50%和75.98%。兩種苜蓿芽苗干重除在20 mmol·L-1(WL343HQ)和25 mmol·L-1(龍牧807)脅迫濃度下，其它脅迫濃度與對照組的芽苗干重比較差異均顯著(P<0.05)。

表4 混合蘇打鹽堿脅迫下苜蓿種子芽苗的干重和鮮重Table 4 Dry weight and fresh weight of alfalfa seed buds under mixed soda salt-alkaline stress

2.3 蘇打脅迫對苜蓿種子的耐鹽堿半致死濃度和耐鹽極限濃度的影響

耐鹽半致死濃度是由低鹽到高鹽脅迫的中轉濃度，是所有耐鹽指標由低鹽處理不規律變化到高鹽濃度的受抑制過程中的一個“轉折點”[5]。在一定蘇打鹽堿濃度范圍內，兩種苜蓿種子發芽率隨脅迫濃度的增加而降低，蘇打鹽堿濃度過高可完全抑制苜蓿種子的萌發。為了確定兩種苜蓿種子耐蘇打鹽堿適宜濃度，試驗以種子發芽率作為蘇打鹽堿脅迫適宜濃度指標，對兩種苜蓿種子的發芽率進行線性回歸，回歸曲線和回歸方程見圖1，確定兩種苜蓿種子對蘇打鹽堿脅迫的半致死濃度和耐鹽極限濃度，WL343HQ對蘇打鹽堿脅迫的半致死濃度和耐鹽極限濃度分別為42.41 mmol·L-1和63.64 mmol·L-1，龍牧807對蘇打鹽堿脅迫的半致死濃度和耐鹽極限濃度分別為36.61 mmol·L-1和54.33 mmol·L-1。

圖1 蘇打鹽堿脅迫下2種苜蓿種子發芽率的變化Fig.1 Changes of germination rate of two alfalfa seeds under soda salt-alkaline stress

2.4 兩種苜蓿種子對蘇打鹽堿抗性綜合分析

兩種苜蓿種子在混合蘇打鹽堿處理下種子萌發的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、胚芽長、胚根長、鮮重和干重8項形態指標變化不同，應用單一指標不能準確反映鹽堿對苜蓿種子萌發的脅迫作用。對不同蘇打鹽堿濃度處理下的兩種苜蓿種子萌發的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、胚芽長、胚根長、鮮重和干重的8項指標進行隸屬函數值計算，將各項隸屬函數值累加進行綜合分析，蘇打鹽堿脅迫對2種苜蓿種子萌發的隸屬函數值綜合分析見表5。WL343HQ和龍牧801苜蓿種子萌發在不同蘇打鹽堿濃度處理下的隸屬值的變化隨著鹽堿濃度的增加而降低，抑制種子的萌發和芽苗的生長，特別是在蘇打鹽堿濃度為40 mmol·L-1和35 mmol·L-1時，可以較好反映出蘇打鹽堿對兩種苜蓿種子萌發的各項形態指標產生的影響。

表5 混合蘇打鹽堿脅迫對兩種苜蓿種子萌發形態指標的隸屬函數值綜合分析Table 5 Comprehensive analysis of subordinate function values of mixed soda salt-alkaline stress on germination morphological indexes of two alfalfa seeds

注：GR，GP，GI，VI，EL，RL，FW，DW分別代表發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、胚芽長、胚根長、鮮重、干重

Notes：GR，GP，GI，VI，EL，RL，FW，DW represent germination rate，germination potential,germination index,vitality index,embryo length，radical length，fresh weight,dry weight respectively

3 討論

鹽堿脅迫是影響生物生長的重要逆境因素之一，通過滲透與離子毒害作用對種子萌發產生抑制作用，而堿脅迫對種子萌發的抑制在鹽脅迫的基礎上還增加了高的pH值作用，造成種子發生離子失衡，因此對植物種子的傷害作用更強[12]。Na2CO3和NaHCO3等堿性鹽所造成的堿脅迫對植物的破壞作用大于由NaCl和Na2SO4等中性鹽所造成的鹽脅迫[13]。本試驗中，隨著蘇打鹽堿濃度的增加，兩種苜蓿種子發芽率呈逐漸下降的變化趨勢，WL343HQ在蘇打鹽堿濃度為20～35 mmol·L-1和龍牧807在20～30 mmol·L-1時苜蓿種子的發芽狀況均表現良好，體現了兩種苜蓿具有一定的抗蘇打鹽堿能力，當蘇打鹽堿濃度超過60 mmol·L-1時，兩種苜蓿種子很難萌發。這與藺吉祥[4]等人研究鹽堿脅迫對紫花苜蓿種子發芽的協同影響的結果一致。高濃度混合鹽堿脅迫抑制種子萌發可能是由于滲透和毒性效應，隨著鹽堿脅迫濃度的增強，WL343HQ和龍牧807的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均呈下降趨勢，特別是在蘇打鹽堿濃度超過40 mmol·L-1(WL343HQ)和 35 mmol·L-1(龍牧807)以上時，嚴重影響了兩種苜蓿種子的萌發。

通過模擬不同的蘇打鹽脅迫環境，發現蘇打鹽脅迫顯著影響苜蓿種子發芽率、種子發芽進程和芽苗的發育，隨著鹽濃度的升高植物種子萌發一般受到抑制，高濃度則會明顯抑制種子萌發[14-15]。在本研究中，只有在兩種堿性鹽(NaCO3+NaHCO3)為低鹽堿濃度的脅迫條件下各項發芽指標與對照比較下降的幅度比較小，隨著蘇打鹽濃度的上升，各項指標均呈明顯下降趨勢或抑制狀態。種子萌發能力和芽苗早期生長是植物耐鹽堿性早期鑒定及耐鹽堿品種早期選擇的基礎。發芽率反映了種子發芽的速率，發芽勢反映種子的質量優劣，發芽指數反映種子的發芽速度和整齊度，而種子活力指數是種子發芽速率和生長量的綜合反映，應用這4個指標能夠全面綜合地反映外源蘇打鹽堿對苜蓿種子發芽的作用。

從胚根長、胚芽長、鮮重和干重的變化上分析，在低蘇打鹽堿濃度脅迫下，胚芽的發育受到促進作用，胚芽長、鮮重和干重下降的幅度小，而在40 mmol·L-1以上的蘇打鹽堿濃度對兩種苜蓿種子的芽苗生長產生嚴重的抑制作用，與藺吉祥等人研究鹽堿脅迫對小麥種子萌發、早期幼苗生長結果一致[16]。特別是在45 mmol·L-1以上的蘇打鹽堿濃度下培養7 d的兩種苜蓿芽苗生長緩慢，有的芽苗開始腐爛，說明高濃度堿性鹽脅迫因其滲透脅迫、離子毒害和高pH值的綜合影響[17-18]，對苜蓿種子的萌發和芽苗生長造成嚴重的傷害作用。

4 結論

在20，25，30，35，40，45，50，55和60 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫下，兩種紫花苜蓿種子除胚芽長度外，發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、胚根長、鮮重、干重均隨蘇打鹽堿濃度升高呈下降的變化趨勢，在相同脅迫濃度下，WL343HQ的各項萌發指標均高于龍牧807，WL343HQ和龍牧807對蘇打鹽堿脅迫半致死濃度分別為42.41 mmol·L-1和36.61 mmol·L-1，WL343HQ的耐蘇打鹽堿能力優于龍牧807。