青藏高原不同海拔梯度黃花棘豆內生真菌多樣性研究

姜哲浩， 周 恒， 張德罡， 陳建綱， 柳小妮

(甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅省草業工程實驗室， 中-美草地畜牧業可持續研究中心，甘肅 蘭州 730070)

黃花棘豆(Oxytropisochrocephala)是草場危害最嚴重的毒草之一[1]，動物長期或過量采食會發生以神經系統機能紊亂為特征的慢性中毒病，嚴重時會致死[2]。苦馬豆素(Swainonine，SW)是黃花棘豆的主要毒性成分[3,4]，但SW在醫學上具有抗腫瘤活性[5,6]、免疫調節[7,8]、抗病毒[9]、抗菌[10]等藥理作用。目前主要通過生物合成、提取及人工合成的方法獲得，但這些途徑成本較高[11]。

真菌在微生物中具有種類多、酶系豐富、次生代謝產物多、培養條件較簡單等特點，常作為發酵中藥的主要功能菌。此外，植物中內生真菌可參與合成和宿主植物相同或相似的活性成分[12]。近年研究結果表明，瘋草(Locoweed)中普遍存在能產生SW的內生真菌，且內生真菌的數量越多，SW的產量越高[13]。20世紀末，Braun[14]從3種美國瘋草中均分離到一類能產生SW的內生真菌，該類真菌生長特性和形態結構相近，根據真菌內部轉錄間隔區(Internal transcribed space，ITS)序列信息，將其初步劃分為鏈格孢屬(Alternaria)真菌；2006 年，Wang等[15]從我國青海的甘肅棘豆(Oxytropiskansuensis)中分離出棘豆埃里磚格孢屬內生真菌(Embellisiaoxytropis)，其形態與Embellisiasp.極為相似，現名為Undifiliumoxytropis。余永濤[16]分別在小花棘豆(Oxytropisglabra)、冰川棘豆(Oxytropisglacialis)、毛瓣棘豆(Oxytropissericopetala)、黃花棘豆和甘肅棘豆等瘋草中分離出菌絲中含有苦馬豆素的埃里磚格孢屬內生真菌，并且將分離自甘肅棘豆的 1株生成苦馬豆素的內生真菌確定為Embellisiasp.。錢亞光等[17]檢測到小花棘豆植株的苦馬豆素含量低于其內生真菌苦馬豆素含量。馬堯等[18]從急彎棘豆(Oxytropisdeflexa)和甘肅棘豆的種子、葉、莖及根中分離到的鐮孢菌屬三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)也檢測到含有苦馬豆素。在小花棘豆中，盧圍等[19]還分離出2株產苦馬豆素的層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)。

野外采集黃花棘豆進行分離以及室內組織培養法獲得的試驗結果不能對植物內生真菌的群落組成進行真實的反映，本試驗擬對黃花棘豆內生真菌的多樣性進行研究，基于IonS5TMXL測序平臺的測序技術，選擇黃花棘豆大量生長的不同海拔梯度，對黃花棘豆未檢測到的以及痕量內生真菌的種類進行高通量測序分析，從而更全面地探析黃花棘豆內生真菌的多樣性，為抑制或高產苦馬豆素提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于青海省南部(31°39′～36°19′ N，89°45′～102°23′ E)，海拔2 500～4 800 m，屬高原大陸性氣候，年日照時數2 550～2 760 h，年均溫—5.6～—3.8℃，年平均降水251～565 mm，6—9月降水量占全年降水量的75%，冷季漫長，無明顯暖季。草地類型為高寒草原，草層高度25～70 cm，草層蓋度56%～95%，土壤類型為高山草原土[20]，土壤質地為砂土[21]，采樣地為冬季牧場，采樣時樣地處于休牧時期，樣地詳情見表1。

1.2 樣品采集

2018年8月在研究區進行植被和土壤樣品采集，在海拔2 500～4 500 m范圍以約500 m高差為間隔分別選取5個樣地(表1)。每個樣地設置3個200 m×200 m的采樣區，選擇30株長勢良好的黃花棘豆，生長時期為盛花期，采集根、莖、葉和花，共計150株，草地上黃花棘豆的密度為7～10 株·m-2。黃花棘豆表面消毒程序為：首先，用體積分數為70%的乙醇浸泡30 s，再用有效氯含量為1%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min，然后用滅菌的去離子水清洗3次，每次1 min，最后使用50 mL滅菌離心管，放入液氮保存；其余部分，帶回實驗室，陰干后粉碎備用。去除土層上的枯落物后，使用土鉆采集0～20 cm土層的樣品，每個海拔梯度5次重復。樣品經過混合密封后帶回實驗室，去除土壤動物和植物殘體，一份土樣測定土壤含水量，另一份自然風干后磨碎，過孔徑0.15 mm和2 mm篩用于指標測定。同時，采用環刀法[22](100 cm3)取樣，測定土壤容重(Soil bulk density,SBD)。

1.3 植物營養成分測定

粗蛋白(Crude protein，CP)：凱氏定氮法[23]測定；粗纖維(Crude fiber，CF)：范式洗滌法[24]測定；粗脂肪(Ether extract，EE)：索氏抽提法[25]測定；粗灰分(Crude ash，ASH)：干灰法[26]測定；無氮浸出物(Nitrogen-free extract，NFE)：NFE%=100%-(CP%+EE%+ASH%+CF%)。

1.4 土壤理化指標

土壤理化指標及測定方法[27]為：土壤含水量(Soil water content，SWC)：105℃烘干法測定；土壤pH值：電位法(水土比為2.5∶1)測定；土壤有機碳(Soil organic carbon，SOC)：重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定；土壤全氮(Total nitrogen，TN)：凱氏定氮法測定；土壤全磷(Total phosphorus，TP)：酸熔-鉬銻抗比色法測定；土壤全鉀(Total potassium，TK)：火焰光度計法測定。

表1 樣地基本信息Table 1 Basic information of the sample plots

1.5 DNA提取及PCR擴增

用真菌DNA提取試劑盒提取植物總基因組DNA，方法參見試劑盒說明書，每個樣品3個重復并進行混合以降低在DNA提取過程中試驗操作產生的誤差。采用ITS5-1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2-2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)進行PCR擴增。PCR擴增體系為：2×Taq PCR MaterMix12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL (對照加1 μL雙蒸水)，最后用雙蒸水補足至25 μL。PCR擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸5 min[28]。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司測序，每個植物樣品3個生物學重復。

1.6 測序數據的處理

使用Cutadapt[29]先對reads進行低質量部分剪切，再根據Barcode從得到的reads中拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列初步質控得到原始數據(Raw reads) 經過以上處理后得到的Reads需要進行去除嵌合體序列的處理，Reads序列通過與物種注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據(Clean Reads)。利用Uparse軟件[30]對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，同時選取OTUs的代表性序列，依據其算法原則，篩選的是OTUs中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。再對OTUs序列進行物種注釋，用Qiime軟件中的blast方法與Unit數據庫進行物種注釋分析。對各樣本的數據進行均一化處理，以樣本中數據量最少的作為標準進行均一化處理。

1.7 統計分析

采用SigmaPlot 14.0作圖，SPSS 21.0軟件對數據進行One-Way ANOVA統計分析和Duncan極差法進行差異顯著性檢驗。使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Chao1指數和Shannon指數，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線和非度量多維尺度分析(Non-metric multidimensional scaling analysis,NMDS)，以門分類水平進行加權Unifrac距離矩陣做UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)聚類分析，以及曼特爾(Mantel test)分析。采用Canoco 5.0軟件對真菌類群及豐度進行除趨勢對應分析(Detrended correspondence analysis,DCA)，對不同物種進行分組和排序，計算其第一排序軸的梯度范圍，根據梯度范圍數值，采用冗余分析(Redundancy analysis,RDA)對真菌群落與植物營養和土壤環境因子間的相互關系進行分析。數據為平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 黃花棘豆營養成分及土壤理化性質

不同海拔梯度黃花棘豆營養成分差異顯著(P<0.05)。如表2所示，隨著海拔高度的增加，CP、CF和EE均呈現先升高后降低趨勢，ASH和NFE均呈現先降低后升高趨勢。

在不同海拔梯度草地土壤中，各樣地理化性質間均差異顯著(P<0.05)。如表3所示，隨著海拔梯度的升高，TP和TK含量逐漸升高，SWC、SBD、SOC和TN均呈先升高后降低趨勢，pH呈先降低后升高趨勢。

注：同列不同小寫字母表示不同海拔梯度之間差異顯著性(P<0.05)，下同

Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between different altitudinal gradients at the 0.05 level,the same as below

表3 各采樣點土壤基本理化性質Table 3 Basic soil physical and chemical properties in different sampling sites

2.2 真菌群落豐度及多樣性差異

Chao1指數可估算樣品中所含OTU數目，數值越大樣本中所含物種越多；Shannon指數可評估樣本中物種組成的豐富度和均勻度。數值越大表示該環境的物種越豐富，各物種分配越均勻。本研究通過高通量測序共得到有效序列3 615 854條(表4)，質控過濾后得到3 607 129條優質序列，片段長度245～292 bp，在97%的相似水平下對序列進行OTUs聚類，共產生750個OTUs(圖1)。質控有效率達99.76%，OTUs的稀釋曲線均趨于平緩，說明所測數據能夠準確反映植物真菌群落信息(圖2)。從表4可以看出Chao1指數為E>B>D>C>A；Shannon指數為B>C>E>A>D。從圖1可以看出，5個海拔梯度植物樣品所共有的OTUs為159個，其中A,B,C,D,E中所特有的OTUs數目分別為42,27,23,27和41個。

表4 樣品序列數統計、豐富度與多樣性指數Table 4 Sample sequence statistics,richness and diversity indices

圖1 樣品韋恩圖Fig.1 Venn diagrams of samples

圖2 樣品稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves for samples

2.3 內生真菌群落分布特征

從門的分類水平看，相對豐度>0.001%的門在A梯度為子囊菌門(Ascomycota，0.657%)、擔子菌門(Basidiomycota，0.466%)、被孢霉門(Mortierellomycota，0.010%)和毛霉門(Mucoromycota，0.001%)；B梯度為子囊菌門(Ascomycota，1.671%)、擔子菌門(Basidiomycota，2.175%)和被孢霉門(Mortierellomycota，0.006%)；C梯度為子囊菌門(Ascomycota，1.282%)、擔子菌門(Basidiomycota，0.171%)、被孢霉門(Mortierellomycota，0.019%)、球囊菌門(Glomeromycota，0.001%)、芽枝霉門(Blastocladiomycota，0.001%)和蟲霉門(Entomophthoromycota，0.001%)；D梯度為子囊菌門(Ascomycota，1.618%)、擔子菌門(Basidiomycota，0.242%)、被孢霉門(Mortierellomycota，0.109%)和球囊菌門(Glomeromycota，0.004%)；E梯度為子囊菌門(Ascomycota，0.830%)、擔子菌門(Basidiomycota，0.187%)、被孢霉門(Mortierellomycota，0.294%)、球囊菌門(Glomeromycota，0.010%)、油壺菌門(Olpidiomycota，0.002%)和壺菌門(Chytridiomycota，0.001%)。主要優勢類群為子囊菌門和擔子菌門。

從綱的分類水平看，相對豐度>0.01%的綱在A梯度為錘舌菌綱(Leotiomycetes，0.028%)、銀耳綱(Tremellomycetes，0.392%)、座囊菌綱(Dothideomycetes，0.529%)、被孢霉綱(Mortierellomycetes，0.010%)、散囊菌綱(Eurotiomycetes，0.010%)、子囊菌綱(Sordariomycetes，0.020%)和傘菌綱(Agaricomycetes，0.012%)；B梯度為錘舌菌綱(Leotiomycetes，0.031%)、銀耳綱(Tremellomycetes，1.669%)、座囊菌綱(Dothideomycetes，1.344%)、被孢霉綱(Mortierellomycetes，0.010%)、子囊菌綱(Sordariomycetes，0.024%)、傘菌綱(Agaricomycetes，0.010%)和外囊菌綱(Taphrinomycetes，0.010%)；C梯度為錘舌菌綱(Leotiomycetes，0.012%)、銀耳綱(Tremellomycetes，0.117%)、座囊菌綱(Dothideomycetes，0.683%)、被孢霉綱(Mortierellomycetes，0.019%)、散囊菌綱(Eurotiomycetes，0.044%)、子囊菌綱(Sordariomycetes，0.028%)、傘菌綱(Agaricomycetes，0.021%)、外囊菌綱(Taphrinomycetes，0.010%)和微球黑粉菌綱(Microbotryomycetes，0.010%)；D梯度為錘舌菌綱(Leotiomycetes，1.044%)、銀耳綱(Tremellomycetes，0.141%)、座囊菌綱(Dothideomycetes，0.384%)、被孢霉綱(Mortierellomycetes，0.107%)、散囊菌綱(Eurotiomycetes，0.010%)、原囊霉綱(Archaeorhizomycetes，0.043%)、子囊菌綱(Sordariomycetes，0.051%)和傘菌綱(Agaricomycetes，0.037%)；E梯度為錘舌菌綱(Leotiomycetes，0.068%)、銀耳綱(Tremellomycetes，0.061%)、座囊菌綱(Dothideomycetes，0.448%)、被孢霉綱(Mortierellomycetes，0.290%)、散囊菌綱(Eurotiomycetes，0.015%)、原囊霉綱(Archaeorhizomycetes，0.119%)、子囊菌綱(Sordariomycetes，0.060%)和傘菌綱(Agaricomycetes，0.083%)。錘舌菌綱隨海拔升高呈先下降后上升趨勢，銀耳綱、座囊菌綱、被孢霉綱、散囊菌綱和外囊菌綱則是先上升后下降，子囊菌綱和傘菌綱隨海拔升高呈上升趨勢，原囊霉綱僅在海拔D、E梯度出現，微球黑粉菌綱僅在C梯度出現。

從屬的分類水平看，相對豐度>0.01%的屬在A梯度為葡萄孢屬(Botrytis，0.010%)、菌屬(Filobasidium，0.214%)、亞隔孢殼屬(Didymella，0.158%)、Boeremia(0.034%)、枝孢屬(Cladosporium，0.054%)、Vishniacozyma(0.089%)、鏈格孢屬(Alternaria，0.064%)、附球菌屬(Epicoccum，0.030%)和被孢霉屬(Mortierella，0.010%)；B梯度為葡萄孢屬(Botrytis，0.010%)、菌屬(Filobasidium，1.141%)、亞隔孢殼屬(Didymella，0.487%)、Boeremia(0.216%)、枝孢屬(Cladosporium，0.354%)、Vishniacozyma(0.367%)、鏈格孢屬(Alternaria，0.010%)和附球菌屬(Epicoccum，0.092%)；C梯度為菌屬(Filobasidium，0.028%)、亞隔孢殼屬(Didymella，0.117%)、Boeremia(0.208%)、枝孢屬(Cladosporium，0.028%)、Vishniacozyma(0.038%)、鏈格孢屬(Alternaria，0.139%)、擬球藻屬(Sphaerellopsis，0.065%)、附球菌屬(Epicoccum，0.012%)和被孢霉屬(Mortierella，0.015%)；D梯度為葡萄孢屬(Botrytis，0.987%)、菌屬(Filobasidium，0.010%)、亞隔孢殼屬(Didymella，0.102%)、Boeremia(0.010%)、枝孢屬(Cladosporium，0.018%)、Vishniacozyma(0.024%)、鏈格孢屬(Alternaria，0.096%)、附球菌屬(Epicoccum，0.010%)和被孢霉屬(Mortierella，0.094%)；E梯度為葡萄孢屬(Botrytis，0.014%)、亞隔孢殼屬(Didymella，0.010%)、Boeremia(0.010%)、鏈格孢屬(Alternaria，0.134%)、附球菌屬(Epicoccum，0.015%)和被孢霉屬(Mortierella，0.262%)。除被孢霉屬呈上升趨勢外，其余各屬均隨海拔升高呈先上升后下降趨勢，擬球藻屬僅在C梯度出現，而葡萄孢屬僅在C梯度未出現。

圖3 真菌群落相對豐度Fig.3 Relative abundance of fungus community注：(a)：門分類水平；(b)：綱分類水平；(c)：屬分類水平；As：子囊菌門；Ba：擔子菌門；Mo：被孢霉門；Gl：球囊菌門；Bl：芽枝霉門；En：蟲霉門；Ch：壺菌門；Ro：隱真菌門；Ol：油壺菌門；Mu：毛霉門；Le：舌菌綱；Tr：銀耳綱；Do：座囊菌綱；Mo：被孢霉綱；Eu：散囊菌綱；Ar：原囊霉綱；So：子囊菌綱；Ag：傘菌綱；Ta：外囊菌綱；Mi：微球黑粉菌綱；Bo：葡萄孢屬；Fi：菌屬；Di：亞隔孢殼屬；Boe：Boeremia；Cl：枝孢屬；Vi：Vishniacozyma；Al：鏈格孢屬；Sp：擬球藻屬；Ep：附球菌屬；Mo：被孢霉屬；Ot：其他；下同Note:(a):Phyla level；(b):Class level；(c):Genus level；As:Ascomycota;Ba:Basidiomycota;Mo:Mortierellomycota;Gl:Glomeromycota;Bl:Blastocladiomycota;En:Entomophthoromycota;Ch:Chytridiomycota;Ro:Rozellomycota;Ol:Olpidiomycota;Mu:Mucoromycota;Le:Leotiomycetes;Tr:Tremellomycetes;Do:Dothideomycetes;Mo:Mortierellomycetes;Eu:Eurotiomycetes;Ar:Archaeorhizomycetes;So:Sordariomycetes;Ag:Agaricomycetes;Ta:Taphrinomycetes;Mi:Microbotryomycetes;Bo:Botrytis;Fi:Filobasidium;Di:Didymella;Boe:Boeremia;Cl:Cladosporium;Vi:Vishniacozyma;Al:Alternaria;Sp:Sphaerellopsis;Ep:Epicoccum;Mo:Mortierella;Ot:Other;the same as below

2.4 Beta多樣性

對5個不同海拔梯度黃花棘豆選用加權Unifrac距離來衡量2個梯度間的差異系數，相異系數越小，2個海拔梯度間物種多樣性的差異越小。如圖4所示，各梯度加權Unifrac差異系數為AB(0.321),AC(0.107)，AD(0.122)，AE(0.133)，BC(0.252)，BD(0.273)，BE(0.281)，CD(0.040)，CE(0.047)，DE(0.028)。通過對各樣品進行UPGMA聚類分析(圖5)發現，D,E梯度間內生真菌組成及豐度相似性較高，B梯度內生真菌組成及豐度與其他梯度差異較大。

圖4 各樣地間OTUs的heatmap分析Fig.4 Heatmap analysis between OTUs of plots

對不同海拔梯度黃花棘豆內生真菌群落進行NMDS分析，結果如圖6所示。同一梯度樣品基本聚集，不同梯度樣品彼此分離，表明不同海拔梯度黃花棘豆內生真菌群落結構組間差異顯著。此外，相較于B,C,D梯度，A梯度與E梯度樣品群落結構距離更遠，表明隨海拔的增加，內生真菌群落結構差異增大。

圖5 門水平上物種組成的UPGMA聚類樹圖Fig.5 UPMGA clustering tree diagram of species composition at phyla level

圖6 各樣地間NMDS分析Fig.6 NMDS analysis of plots

2.5 真菌優勢類群與植物營養成分和土壤環境因子間RDA分析

基于CANOCO 5.0軟件分析，將真菌類群及豐度進行物種間的DCA，對不同物種進行分組和排序，計算其第一排序軸的梯度范圍為1.1，說明真菌優勢類群與植物營養成分和土壤環境因子之間適合RDA分析。通過RDA分析并結合Pearson相關系數分析，初步說明真菌優勢類群與植物營養成分和土壤環境因子間的相互關系(圖7，表5)。RDA分析表明：第一、二排序軸特征值分別為0.5976和0.3289，第一、二排序軸累計解釋率分別為59.76%和92.65%，具有生物統計學意義。其中優勢類群子囊菌門與NFE呈顯著負相關(相關系數為—0.616)；擔子菌門與TN、TP呈顯著負相關(相關系數分別為—0.537,—0.558)；被孢霉門和壺菌門與ASH呈極顯著正相關(相關系數為0.882,0.754)；球囊菌門和油壺菌門與海拔呈極顯著正相關(相關系數分別為0.812,0.661)；蟲霉門與SOC呈極顯著正相關(相關系數為0.668)；毛霉門和隱真菌門與植物營養和土壤環境因子無顯著相關性。

圖7 真菌優勢類群與植物營養成分和土壤環境因子之間的冗余分析Fig.7 Redundancy analysis of dominant fungal groups,plant nutrients and soil environmental factors注：As：子囊菌門；Ba：擔子菌門；Mo：被孢霉門；Gl：球囊菌門；Bl：芽枝霉門；En：蟲霉門；Ch：壺菌門；Ro：隱真菌門；Ol：油壺菌門；Mu：毛霉門；CP：粗蛋白；CF：粗纖維；EE：粗脂肪；ASH：粗灰分；NFE：無氮浸出物；SWC：土壤含水量；SBD：土壤容重；SOC：土壤有機碳；TN：全氮；TP：全磷；TK：全鉀Note:As:Ascomycota;Ba:Basidiomycota;Mo:Mortierellomycota;Gl:Glomeromycota;Bl:Blastocladiomycota;En:Entomophthoromycota;Ch:Chytridiomycota;Ro:Rozellomycota;Ol:Olpidiomycota;Mu:Mucoromycota;CP:Crude protein;CF:Crude fiber;EE:Ether extract;ASH:Crude ash;NFE:Nitrogen-free extract;SWC:Soil water content;SBD:Soil bulk density;SOC:Soil organic carbon;TN:Total nitrogen;TP:Total phosphorus;TK:Total potassium

表5 真菌優勢類群與植物營養成分和土壤環境因子之間的相關性分析Table 5 The correlation analysis of dominant fungal groups,plant nutrients and soil environmental factors

注：*表示顯著相關(P<0.05)；**表示極顯著相關(P<0.01)

Note：*means significant correlation at the 0.05 level；**means extremely significant correlation at the 0.01 level

Mantel test分析(表6)表明，植物CP以及土壤pH,SOC,TN,TP和TK是影響不同海拔黃花棘豆內生真菌群落的主要因子(P<0.01)；植物EE和SWC對真菌植物優勢類群影響較小；Mantel test與RDA分析結果基本吻合。

表6 植物營養成分和土壤環境因子的曼特爾分析Table 6 Mantel test analysis of plant nutrients and soil environmental factors

3 討論

植物體內分布有大量的微生物，這些微生物與寄主植物體內相應的生態空間結構相互作用，形成生理性統一體[31]。內生真菌是共生于健康植物組織內而不引起植物病變和排斥的真菌[32]。本研究基于IonS5TMXL平臺，利用Single-End的方法，研究了不同海拔梯度的黃花棘豆真菌群落。研究發現，真菌群落Chao1指數為E>B>D>C>A，表明隨海拔升高，物種豐富度大致呈增長趨勢，在海拔4 493 m處，物種豐度達到最大，該海拔NFE含量較高，反映了淀粉糖類的積累有利于真菌的生長；Shannon指數為B>C>E>A>D，表明物種多樣性在海拔3 000～3 500 m左右達到最高，過高或過低的海拔均會對內生真菌物種多樣性造成影響。隨著海拔的增高，氣溫降低、晝夜溫差加大，嚴酷的環境限制了一些真菌的生長，進而限制了黃花棘豆內生真菌數量[33]。

本研究發現，海拔梯度對黃花棘豆微生物群落的影響主要在于微生物量的變化，對于微生物群落結構的影響并不明顯，各海拔梯度間具有相類似的優勢菌群，從門水平上來看，隨海拔的上升，子囊菌門和擔子菌門均屬優勢菌群，數量呈先上升后下降的趨勢，均在海拔3 005 m處達到最高，但兩種真菌豐度變化差異較大。Frey[34]研究表明，子囊菌門多數為腐生菌，主要作用是分解植物殘體和降解土壤有機質，而擔子菌門分解木質纖維素的能力較強。本試驗中子囊菌門之所以能占比最大，可能是因為其無性繁殖能力很強，能產生大量的分生孢子，增長迅速，使其在數量上占優勢[35]，這說明海拔梯度對黃花棘豆微生物量的影響強度高于對微生物群落結構的影響，或本研究中海拔梯度變化程度未達到引起黃花棘豆微生物群落結構顯著變化的閾值。從屬的水平來看，每個海拔梯度均發現目前已知的能產生苦馬豆素的鏈格孢屬真菌，但隨海拔梯度的上升，數量增加，在海拔3 490 m處達到最高，說明高海拔地區可能更加利于產苦馬豆素，但鏈格孢屬真菌在整個屬分類水平下所占的相對物種豐度比例僅為0.01%～0.14%。海拔3 005 m處，物種豐富度與多樣性均較高，但鏈格孢屬真菌所占的物種豐度比例反而是各個海拔梯度中最低的，僅為0.01%，這表明鏈格孢屬可能在植物體內不屬于具有競爭性的優勢菌種。

本研究采取的植物樣品所測得的試驗結果，內生真菌群落的相對豐度均較小，樣品稀釋曲線表明測序深度已基本達到，但仍出現這種結果，究其原因可能是因為黃花棘豆內生真菌數量只在植物體內占極少部分，也可能是因為青藏高原特殊的環境因素，研究區低溫環境限制有機物的可利用性，不利于植物的生長，微生物遇到惡劣環境時進入休眠狀態更是普遍現象。研究發現[36]，土壤有機碳含量變化與物種多樣性變化規律相一致，土壤有機碳作為土壤性質的重要指標，在一定程度上影響了植物的生長，進而影響植物內生真菌的分布。有研究[37,38]表明，微生物在pH近中性時多樣性最高，土壤pH一旦偏離中性，植物微生物群落會受到環境脅迫壓力，導致多樣性降低。土壤肥力和植物營養與植物內生真菌密切相關。本研究通過RDA并結合Mantel test分析了真菌優勢類群與植物營養以及土壤環境因子之間的相互關系，結果表明，內生真菌種群數量的變化主要受植物體內CP及土壤環境因子(pH,SOC,TN,TP和TK)的影響，究其原因可能是土壤營養物質及植物營養的減少引起微生物生存與繁殖環境變劣，使微生物數量和活力大幅度下降。

4 結論

不同海拔梯度黃花棘豆真菌群落的多樣性無明顯差異；而真菌群落豐度在海拔3 005 m處最高。研究區各海拔黃花棘豆真菌群落組成的優勢類群均為子囊菌門和擔子菌門。隨著海拔升高，黃花棘豆內生真菌多樣性先增后降，內生真菌種群數量的變化主要受植物體內CP及土壤pH,SOC,TN,TP和TK的影響。