飼用糞腸球菌EXW27 培養條件的響應面優化

郭建軍， 熊大維， 曾 靜， 魏國汶， 杜建華， 袁 林*

（1.江西省科學院微生物研究所，江西南昌330096；2. 南昌工學院，江西南昌330108）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）又叫糞鏈球菌，是屬于腸球菌屬的一種兼性厭氧型乳酸菌，細胞呈圓形或橢圓形，成雙或短鏈狀排列，對環境適應力和抵抗力強（張艷萍等，2016）， 可耐受四環素、卡那霉素、慶大霉素等多種抗生素，農業部將糞腸球菌列入《飼料添加劑品種目錄（2013）》，適用于養殖動物（張娟等，2019）。糞腸球菌繁殖速度快、能產生多種抗菌物質，如細菌素、有機酸、抗菌肽等對腸道中的沙門氏菌、 大腸桿菌等致病菌具有良好的抑制作用（寶冠媛等，2015），激活腸道的免疫功能或刺激機體的免疫系統 （Al Atya 等，2015）；糞腸球菌在動物消化道內生長增殖過程中會產生活性物質，如維生素和消化酶，能提高機體的消化功能，促進動物對飼料的利用，有效調節腸道微生態平衡，促進動物生長，提高動物的生產性能（張群等，2016）。

影響菌株生產能力的因素不僅包括菌種本身的生理性能，還有外界合適的環境條件，所以通過優化菌株的培養條件可改進發酵過程。 白文妹等（2017） 對金絲猴源益生糞腸球菌dlt7a 的發酵工藝進行優化，活菌數可達5.883×109cfu/mL；焦月華等（2016）研究有氧呼吸條件下糞腸球菌LD33高密度增殖中發現， 在進行有氧呼吸代謝時能夠顯著提高糞腸球菌生物量和存活率； 但每種菌株的生長特性不同， 菌株在發酵培養基中的繁殖力各異， 生產中需要針對每種菌株進行培養條件的優化，以提高菌株發酵的活菌數。本課題組從健康仔豬腸道黏膜上分離到一株具有良好益生特性和安全性糞腸球菌EXW27， 通過Plackett-Burman試驗和響應面試驗對該菌株搖瓶發酵培養條件進行優化，提高其在發酵培養過程中的活菌數，確定高密度培養工藝， 以期為后期大規模工業化生產優質的微生態制劑奠定工藝基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試菌株： 糞腸球菌EXW27 由本課題組從健康仔豬腸道黏膜上篩選得到， 具有優良的益生潛力。

發酵培養基：蔗糖50 g、蛋白胨30 g、酵母粉9.0 g、 檸檬酸氫二銨3.5 g、K2HPO4·7H2O 3.75 g、NaAc·3H2O 6.25 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、MnSO4·H2O 0.45 g、組氨酸1.4 g、碳酸鈣10 g、去離子水定容至1000 mL，115 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體培養 菌種活化： 將保存的糞腸球菌EXW27 接種至MRS 斜面培養基上活化，37 ℃恒溫培養24 h， 連續轉接活化兩次； 再用接種環刮取兩環接種至液體MRS 培養基中， 于37 ℃、120 r/min 培養10 h 作為種子菌液。

搖瓶發酵培養： 在三角瓶中裝入發酵培養基后滅菌，無菌條件下向三角瓶內接入種子菌液；初始發酵培養條件為：250 mL 三角瓶裝100 mL 培養基，接種量5%，初始pH 6.8，37 ℃，150 r/min，搖瓶培養20 h。

活菌含量測定：計數方法采用固體MRS 傾注法，取100 μL 發酵液液加入900 μL 滅菌生理鹽水中，依次做10 倍稀釋，選取3 個適宜的連續稀釋倍數進行平板計數，每個稀釋度做3 個平行。

1.2.2 單因素試驗選取因素水平 本試驗對糞腸球菌發酵過程中培養基的初始pH、接種量、培養溫度、裝液量、轉速5 個因素進行了單因素試驗，分別設置了不同梯度， 通過測定發酵培養液的菌株EXW27 活菌含量選取最適的單因素水平。

1.2.3 Plackett-Burman 試驗 在單因素試驗的基礎上， 選取可能影響糞腸球菌發酵培養活菌含量的6 個因素：裝液量、初始pH、溫度、搖床轉速、接種量、培養時間，采用Design-Expert 8.0.6 軟件的Plackett-Burman 試驗設計對上述因素進行研究， 篩選出其中對糞腸球菌發酵液活菌含量具有顯著性影響作用的因素。

1.2.4 最陡爬坡試驗 根據Plackett-Burman 設計的各因素水平及效應評價， 分析出影響腸球菌發酵液活菌含量關鍵因素， 并確定關鍵因子的爬坡方向和變化步長，進行最陡爬坡試驗，使關鍵因素濃度最大限度靠近響應值極大區， 找出發酵液活菌含量的發酵條件，即為響應面分析的中心點。

1.2.5 響應面試驗 由最陡爬坡試驗確定接近響應面區域顯著因素的具體濃度， 利用Box-Bohnken（ BBD）與響應面分析相結合，以糞腸球菌發酵液活菌含量作為響應值， 以Plackett-Burman 試驗確定的3 個顯著因素為自變量， 以最陡爬坡試驗確定的因素最佳水平作為中心點進行3因素3 水平試驗，用DesignExpert 8.0.6 軟件通過試驗數據擬合得到二階響應面模型， 最終確定最優試驗條件。

1.2.6 驗證試驗 用所得到的最佳培養條件進行3 次平行試驗，取平均值，以驗證模型是否可靠，進而得出最終優化結果。

2 結果分析

2.1 糞腸球菌菌體生長曲線 以培養時間為橫坐標，OD600nm值、pH 及活菌含量為縱坐標， 繪制糞腸球菌的生長曲線，結果如圖1 所示。

圖1 糞腸球菌EXW27 生長曲線

由圖1 可知， 糞腸球菌在接種后0 ～5 h 處于遲滯期，菌體緩慢生長，此時，隨著菌體的生長，菌液的pH 開始下降，說明菌體發酵開始產酸；在6 ～14 h 處于對數生長時期，菌體生長迅速，同時pH 下降速率較慢， 說明在此時期菌體產酸較少；當培養14 ～18 h，pH 趨于平穩， 進入穩定期，菌體生長速率保持平穩。 18 h 之后，活菌含量出現下降，OD600nm值處于平穩狀態， 但活菌含量開始緩慢減少，說明菌體生長進入到了衰亡期；在生長過程中pH 不斷降低， 說明整個過程在不斷的產酸，代謝物酸濃度累積到一定量時，開始抑制菌體生長，因此將優化試驗的發酵時間設為18 h。

2.2 單因素試驗結果 不同因素對糞腸球菌活菌濃度的影響見表1。培養基中pH 會影響細胞代謝酶活性和營養物質的離子化程度， 進而影響微生物生長代謝。 起始pH 不同的培養基培養后，糞腸球菌活菌數隨著初始pH 的升高， 呈現先增加后減少的總體趨勢，在初始pH 為7.0 時，活菌生物量最多； 不同接種量培養后活菌數存在較大的差異，當接種量為6%時，菌體活菌含量明顯高于其他組；當在不同溫度條件下培養18 h，發現在36 ℃培養時活菌含量達到最大值1.13×1010cfu/mL，這可能是由于溫度過低，酶活性受抑制， 酶促反應遲緩， 導致菌體生長和代謝緩慢，但當溫度過高時，抑制細菌的生長，甚至不利于菌株的存活。

表1 不同因素對糞腸球菌培養活菌濃度的影響

表2 Plackett-Burman 試驗設計及結果

表3 Plackett-Burman 試驗方差分析

糞腸球菌是一種兼性厭氧的乳酸菌， 低的裝液量使得液體培養基中溶解氧升高，不適于菌體生長繁殖和代謝的要求。從表1 可以看出，在250 mL三角瓶中分別裝入60、90、120、150、180 mL 發酵培養基的變化過程中，乳酸菌活菌含量有一個明顯的先增加后減少的趨勢，當裝液量為120 mL 時，活菌濃度達到最大值； 當搖床轉速由75 r/min 增加到200 r/min 時， 活菌含量先增加后下降， 當轉速為150 r/min 時活菌含量達到最大值。

2.3 Plackett-Burman 試驗篩選發酵的重要因素在上述單因素試驗的基礎上，將發酵培養條件（初始pH、接種量、培養溫度、裝液量、轉速、培養時間）分別作為PB 試驗設計中的6 個優化因素A、B、C、D、E、F，選用n=14 的PB 試驗設計，每個因素分別取2 個水平，通過不同組合觀察發酵液中的EXW27 菌株活菌含量，結果見表2。PB 設計的各因素水平及效應評價見表3，從表3 可以看出，在EXW27 菌株發酵培養過程中，初始pH、培養溫度、 搖床轉速對試驗結果的影響，P 均小于0.01，達到極顯著水平；試驗中模型的決定系數R2為95.94%，其校正后的決定系數R2adj為92.47%，不能由此模式解釋的基本不足10%， 結果可信。因此確定初始pH、培養溫度、搖床轉速作為下一步試驗的關鍵因素。 其他因素的取值可以根據各因素效應的正負和大小，正效應的因素取較高值，負效應的因素取較低值。

2.4 最陡爬坡試驗結果 根據Plackett-Burman試驗結果及顯著性分析結果， 設定3 個顯著性影響因素的方向與步長， 具體試驗設計及結果如表4。 由表4 可知， 第3 組發酵培養條件對應的EXW27 菌株活菌含量為最高值， 故以初始pH 7.5、培養溫度38℃、搖床轉速200 r/min（第3 組的條件）作為中心點，進行響應面分析。

表4 最陡爬坡試驗設計與結果

2.5 響應面試驗優化發酵培養條件 以初始pH 7.5、培養溫度38 ℃、搖床轉速200 r/min 為影響因素，以菌株EXW27 活菌數（R）為響應值，通過Design-Expert.8.0.6 的Box-Behnken 中 心 組 合 設計對菌株EXW27 的培養條件設計了3 因素3 水平試驗，試驗設計與結果見表5。

采用Design-Expert 軟件對試驗數據進行ANOVA 分析， 各因素經過擬合得到的二次多項式回歸模型方程為：

表5 響應面分析試驗設計與結果

該二次多項模型及其各項的方差分析結果見表6。 由表6 可以看出， 模型F 值=208.932，P ＜0.0001，說明該回歸方程是極顯著的；失擬項不顯著 （P=0.1759＞0.05）， 表明回歸方程具有顯著意義?；貧w模型的相關系數R2=99.52%，說明該模型與實際情況擬合程度較好， 試驗設計可靠， 僅有0.48%的變異不能由此模型解釋， 故可以用該模型對菌株EXW27 不同培養條件下的生長情況進行分析和預測。

表6 回歸模型方差分析

為綜合考察交互項對菌株EXW27 活菌數的影響，對表2 數據進行回歸擬合和響應面回歸分析繪出響應面圖形，結果見圖2。 由圖2 可知，搖床轉速、初始pH、裝液量對菌株EXW27 活菌數影響均呈拋物面型關系， 且響應面均存在一個極大值點，其中培養溫度和搖床轉速之間的交互作用最為顯著，這一結果與回歸方程的交互項顯著性分析結果相符。 對回歸方程進行分析，得到各個因素的最佳發酵培養條件為初始pH 7.74、培養溫度38.32 ℃、搖床轉速209.7 r/min， 在該條件下獲得的菌株EXW27 活菌數理論值為3.29×1010cfu/mL。

圖2 培養溫度、初始pH 及轉速對菌株EXW27 活菌數影響的等高線和響應面圖

2.6 最佳搖瓶發酵工藝條件的驗證 在預測出最佳工藝條件的基礎上， 考慮到實際操作中的簡便性等問題將該條件修正為：初始pH 7.7、培養溫度38.3 ℃、 裝液量120 mL/250 mL、 接種量6%、搖床轉速210 r/min、培養時間18 h，在此工藝條件下進行3 次平行試驗， 得到該乳酸菌菌株EXW27 活菌數為3.18×1010cfu/mL， 驗證值和模擬值較為接近， 說明采用響應面法得到的該模型結果較為可靠， 擁有一定實用價值。 與初始發酵培養條件活菌數1.01×1010cfu/mL 相比，優化后結果提高了3.14 倍。

3 結論與討論

因每種菌株的生長特性不同， 菌株在發酵培養基中的繁殖力各異，這就要求在實際的生產中，針對不同的菌株優化其培養條件。 響應面法適合優化影響因素較多且各因素間關系較復雜的工藝，與正交設計試驗相比，響應面法優化菌株的發酵條件，可以縮短試驗用時，并且可以篩選理論上的最佳發酵條件， 與正交法相比更精確。 周英等（2012） 采用正交法優化的糞腸球菌F71 的最適pH 為9.0，最佳培養溫度為35 ℃，較初始提高了54.6%。 白文妹等（2017）確定金絲猴源益生糞腸球菌dlt7a 最佳培養條件為裝液量20%（50 mL/250 mL），接種量2%，培養基初始pH 6.5，在此條件下培養dlt7a 菌株， 活菌數可達5.88×109cfu/mL，比優化前提高了46.53%。莫海燕等（2013）優化的糞腸球菌ef-2 在最適初始pH 8.0，溫度34 ℃，裝液量20 mL/250 mL， 種齡20 h 等發酵條件下糞腸球菌的活菌數從初始的5.8×108cfu/mL 提高到6.7×109cfu/mL。 杜志琳等 （2015） 對糞腸球菌HEW-A152 的發酵工藝進行優化， 在種齡14 h，接種量5%，轉速120 r/min 等條件下發酵18 h 時HEW-A152 菌株活菌數達140×108cfu/mL。

本試驗結果表明， 菌株EXW27 最佳發酵培養條件為：初始pH 7.7、培養溫度38.3℃、裝液量120 mL/250 mL、接種量6%、搖床轉速210 r/min、培養時間18 h，在此條件下，菌株EXW27 的活菌數為3.18×1010cfu/mL， 比優化前提高了3 倍多。本試驗研究了糞腸球菌EXW27 的最佳培養條件，明確其發酵代謝途徑中的一些規律，可為其工業深層發酵提供理論基礎。關于該菌的中試發酵，有待于進一步研究。