干旱脅迫下H2S對板栗幼苗葉片抗氧化特性的影響

孫曉莉　付瑩　田壽樂　王金平　沈廣寧

摘要：為探討干旱脅迫下外源H2S對板栗葉片抗氧化特性的影響，本研究以黃棚板栗幼苗為試材，利用PEG模擬干旱環境，硫氫化鈉（NaHS）和次?；撬幔℉T）分別作為H2S供體和清除劑，設計NaHS、PEG、NaHS+PEG、PEG+HT、NaHS+PEG+HT、HT 6個處理，以澆灌Hoagland 營養液為對照（CK），分別測定不同處理下板栗幼苗葉片SOD、POD、CAT、APX活性和丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）、脯氨酸（Pro）含量。結果表明：0.5 mmol/L NaHS顯著增強葉片SOD、POD、CAT、APX活性，提高葉片Pro含量，顯著降低葉片MDA、H2O2含量，從而減輕干旱脅迫對植物造成的膜脂過氧化損失，提高板栗幼苗對干旱逆境的適應能力，而添加清除劑HT則逆轉了其作用。

關鍵詞：板栗;硫化氫;干旱脅迫;抗氧化特性

中圖分類號：S664.201文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）11-0035-05

Effect of Exogenous Hydrogen Sulfide on Antioxidant

Characteristics in Leaves of Chestnut Seedlings under Drought Stress

Sun Xiaoli1， Fu Ying2， Tian Shoule1， Wang Jinping1， Shen Guangning1

（1. Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China;

2. Zoucheng National Resources and Planning Bureau， Zoucheng 273500， China）

Abstract Using Huangpeng chestnut seedlings as experimental materials， the activities of antioxidant enzymes such as SOD， POD， CAT and APX in leaves under drought stress simulated by PEG were measured by using H2S donor sodium thiohydrate （NaHS） and scavenging agent subtaurine （HT）. Six treatments were designed as NaHS， PEG， NaHS+PEG， PEG+HT， NaHS+PEG+HT and HT with the Hoagland solution as control （CK）. The contents of malondialdehyde （MDA）， hydrogen peroxide （H2O2），proline （Pro） and the activities of SOD， POD， CAT and APX were determined under different treatments. The results showed that the treatment of 0.5 mmol/L NaHS significantly increased the activities of SOD， POD， CAT and APX and the Pro content in leaves， but decreased the contents of MDA and H2O2 significantly， so the membrane lipid peroxidation damage was alleviated， and the tolerance of chestnut seedlings to drought stress was enhanced. However， the addition of H2S scavenger HT reversed the above effects.

Keywords Chinese chestnut; Hydrogen sulfide; Drought stress; Antioxidant characteristics

干旱是影響我國農業生產最嚴重的氣象災害，常導致植物生長代謝受阻、蛋白質合成降低，影響作物的高質高產。而葉片作為植物遭受干旱脅迫下反應最敏銳的器官，對缺水非常敏感，因此探討干旱脅迫下葉片的相關生理指標變化對指導農業生產具有重要的參考價值。硫化氫（hydrogen sulfide， H2S）無色易溶于水，具有明顯臭雞蛋氣味，是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三大內源性氣體信號分子[1]。它參與植物生長發育全過程，具有劑量效應。生理濃度H2S可促進植物干物質積累、胚乳利用及根系形態建成[2]，調節生理生化過程如物質代謝、光合作用、抗衰老等[3-8]，保障植物抵御非生物脅迫如干旱、鹽、高溫、重金屬脅迫等[9-13]。

H2S對干旱脅迫的緩解作用已經在多個樹種上得到證實。外源提供的H2S供體主要是NaHS和GYY4137，其釋放的H2S也可被植物體吸收，同樣引發植物耐逆性的形成[14，15]。試驗中多采用NaHS作為H2S供體進行科學研究。已有研究表明，NaHS處理可提高蠶豆和蘇丹鳳仙花的相對含水量來緩解干旱脅迫引起的損傷[3];外源H2S通過增強水解酶和抗氧化保護酶的活性可有效緩解干旱脅迫造成的傷害，提高黃瓜種子的萌發率[16];0.3 mmol/L NaHS可顯著提高玉米葉片及根系的相對含水量，增強光合能力與根系活力，提高玉米幼苗抗旱性[12];外源H2S通過調控菠菜可溶性多糖、多胺（polyamines）和甘氨酸甜菜堿（glycinebetaine）的生物合成提高葉片相對含水量等，從而增強菠菜的抗旱能力[17]。這充分表明H2S正向調控植物對干旱脅迫的響應。

板栗（Castanea mollissima）是我國優勢特色經濟林樹種、農業部地理標志農產品，對支撐山區農業經濟和生態建設作用顯著[18]，研究板栗的抗旱能力對其穩定發展具有重要現實意義。本研究用PEG模擬干旱環境，以硫氫化鈉（NaHS）、次?；撬幔℉T）作為H2S供體、清除劑，對黃棚板栗一年生實生幼苗進行不同處理，探討硫化氫提高板栗抗逆性的生理機理，以期為解決板栗春季干旱問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試板栗為黃棚板栗，由山東省果樹研究所萬吉山試驗基地提供。

1.2 試驗方法

試驗于2016年5—7月在山東農業大學園藝試驗站進行。將飽滿整齊的黃棚板栗種子播種至陶盆內，其基質內含石英砂。澆灌Hoagland營養液，至幼苗3～4片真葉時，選擇生長整齊的植株進行處理。具體處理如下，其中對照CK：Hoagland 營養液;NaHS處理：Hoagland 營養液+0.5 mmol/L NaHS; PEG處理：Hoagland營養液+15% PEG;NaHS+PEG處理：Hoagland 營養液+15% PEG+0.5 mmol/L NaHS;PEG+HT處理：Hoagland營養液+15% PEG+0.3 mmol/L HT;NaHS+PEG+HT處理：Hoagland 營養液+15%PEG +0.5 mmol/L NaHS+0.3 mmol/L HT;HT處理：Hoagland營養液+0.3 mmol/L HT。每處理重復3次，溶液總體積100 mL。處理24 h后分別取葉片液氮速凍，存于-80℃備用。

1.3 測定指標及方法

過氧化氫（H2O2）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定;脯氨酸（Pro）含量采用磺基水楊酸提取、茚三酮顯色法測定;丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定。

1.4 數據處理

試驗數據用DPS v7.05統計軟件進行數據分析，Microsoft Excel 2003軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下H2S對板栗幼苗葉片SOD、POD、CAT、APX活性的影響

由圖1可以看出，與CK相比，單獨H2S處理略上調板栗葉片4種抗氧化酶活性，但不顯著;單獨HT（H2S抑制劑）處理的POD活性顯著高于CK，SOD、CAT活性略高于CK;PEG脅迫引起板栗葉片SOD、POD、CAT、APX活性顯著升高，較CK分別提高65.60%、72.80%、159.14%、18.21%;與單獨PEG脅迫相比，PEG+NaHS處理下SOD、POD、CAT、APX活性分別提高37.68%、21.53%、29.99%、13.28%，差異顯著;PEG+HT處理與PEG處理相比，SOD、POD、APX活性下降明顯，CAT活性略微上升，但不顯著; PEG+NaHS+HT處理下SOD、POD、CAT活性略高于PEG處理，差異不顯著。表明添加H2S可提高抗氧化酶的活性，增強干旱脅迫下細胞對ROS的清除能力，從而增強板栗幼苗抗旱能力，而添加HT處理使NaHS的效果被抑制。

2.2 干旱脅迫下H2S對板栗幼苗葉片MDA、H2O2含量的影響

由圖2、3可以看出，與正常生長條件下的CK相比，NaHS處理及HT處理下板栗葉片MDA、 H2O2含量略有上下浮動但不顯著。而PEG處理導致MDA、H2O2含量顯著升高，分別較CK升高79.09%、42.38%，差異顯著;與PEG處理相比，PEG+NaHS處理顯著降低板栗葉片MDA、H2O2含量，分別降低23.13%、20.95%，差異顯著;PEG+NaHS+HT及PEG+HT處理下MDA、H2O2含量與PEG處理相比略有上下浮動但差異不顯著。表明外源H2S處理明顯抑制干旱脅迫下ROS的積累，緩解干旱脅迫引起的氧化損傷，而添加HT抑制了H2S的功能，未能有效緩解細胞膜脂過氧化傷害。

2.3 干旱脅迫下H2S對板栗幼苗葉片Pro含量的影響

由圖4可以看出，NaHS和HT處理下板栗葉片脯氨酸含量與CK差異不顯著;PEG處理下葉片脯氨酸含量顯著升高，相比CK增加39.11%;與PEG處理相比，PEG+NaHS處理顯著提高干旱脅迫下板栗葉片脯氨酸含量，升幅為27.65%，兩者差異顯著;PEG+NaHS+HT、PEG+HT處理的板栗葉片脯氨酸含量略有提高，差異不顯著。表明H2S顯著提高干旱脅迫下板栗葉片脯氨酸含量，而添加清除劑HT處理對脯氨酸含量變化無明顯效果。

3 討論與結論

干旱脅迫常會導致植物光合電子傳遞鏈的過度還原，并在葉綠體及線粒體中產生大量活性氧[19]，從而引起細胞膜系統損傷，破壞代謝平衡，促使植物自身啟動抗氧化防御系統，其中SOD、CAT、POD、APX等抗氧化酶類在活性氧的清除過程中起重要作用[20]，可防御干旱脅迫引起的ROS傷害[21]。 H2S作為一種氣體信號分子可直接或間接地參與細胞、組織、器官等的信號傳遞[22]，它可以提高SOD、CAT、POD、APX活性，緩解干旱、鹽及重金屬脅迫引起的損傷，提高植物抗逆能力[23-28]。因此，H2S在提高植株抵抗逆境脅迫中起積極作用，主要通過提高抗氧化酶的活性實現。本研究表明，干旱脅迫導致板栗幼苗葉片的氧化還原平衡被破壞，體內SOD、CAT、POD、APX活性顯著升高以消除活性氧帶來的傷害;與單獨PEG處理相比，PEG+NaHS處理顯著提高板栗葉片抗氧化酶活性，增強抗氧化系統的防御能力，維持植物體穩態，緩解干旱脅迫引起的細胞膜結構和功能損傷;而PEG+NaHS+HT與PEG+HT處理下抗氧化酶活性相對PEG處理上下略有浮動，差異不顯著，表明HT使NaHS的效果被解除。這充分表明硫化氫在抵御干旱脅迫過程中發揮積極作用。

逆境脅迫下MDA、H2O2含量可有效反映植物膜受損和膜脂過氧化程度[29，30]。MDA是植物體內膜脂過氧化反應的最終分解產物，其含量高低能反映膜脂受傷害的程度。H2O2是植物有氧代謝的副產物，可調節植物對環境的適應能力。逆境下脯氨酸可作為植物合成的滲透調節相關物質提高植物滲透調節能力，其偶極性可以維持膜蛋白形態完好，降低植物水分散失[31];干旱脅迫下，細胞能主動積累脯氨酸以維持組織內各種酶類和細胞膜結構的正常功能[32]。因此，MDA、H2O2、Pro可作為評價植物抗旱能力的重要指標。本試驗中，干旱脅迫導致板栗幼苗葉片MDA、H2O2、Pro含量顯著升高，而添加NaHS處理顯著降低葉片MDA、H2O2含量，進而減弱膜脂過氧化水平并穩定膜結構，此外，還顯著增加葉片脯氨酸含量，從而增大細胞質濃度、降低滲透勢，調節細胞的滲透平衡，使細胞在低滲透勢條件下仍能從胞外吸水，維持細胞和蛋白質結構的穩定，最終增強了板栗的抗旱性。這與趙敏等[33]關于高山離子芥的研究一致。而添加HT處理則抑制了H2S的有效功能，對MDA、H2O2、Pro含量影響較大。

綜上所述，干旱脅迫導致板栗幼苗葉片SOD、POD、CAT、APX活性顯著提高，MDA、H2O2、脯氨酸含量顯著增加。添加外源H2S可顯著提高葉片抗氧化酶活性，增加Pro含量，顯著降低MDA、H2O2含量，從而減輕干旱脅迫對植物造成的膜脂過氧化損失，提高板栗幼苗對干旱逆境的適應能力，而添加H2S清除劑HT的處理，則逆轉了上述緩解作用。由此表明H2S在提高植物抗旱性過程中起積極作用，從而為深入研究H2S提高植物抗旱性提供了依據。

參 考 文 獻：

[1]Wang R. Physiological implications of hydrogen sulfide： a whiff exploration that blossomed[J]. Physiological Reviews， 2012， 92（2）： 791-896.

[2]梁崢， 湯佩松. 硫化氫和低溫對水稻幼苗生長和呼吸的影響[J]. 植物生理學通訊，1980（6）：19-23.

[3]García-Mata C， Lamattina L. Hydrogen sulphide， a novel gasotransmitter involved in guard cell signaling[J]. New Phytologist， 2010， 188 （4）： 977-984.

[4]Lisjak M， Srivastava N， Teklic T， et al. A novel hydrogen sulfide donor causes stomatal opening and reduces nitric oxide accumulation[J]. Plant Physiol. Biochem.， 2010， 48：931-935.

[5]Liu J， Hou Z H， Liu G H， et al. Hydrogen sulfide may function downstream of nitric oxide in ethylene-induced stomatal closure in Vicia faba L.[J]. Journal of Integrative Agriculture， 2012， 11（10）：1644-1653.

[6]Jin Z P， Wang Z Q， Ma Q X， et al. Hydrogen sulfide mediates ion fluxes inducing stomatal closure in response to drought stress in Arabidopsis thaliana[J]. Plant and Soil， 2017， 419（1/2）：141-152.

[7]李東波， 肖朝霞， 劉靈霞， 等.外源硫化氫對豌豆根尖及其邊緣細胞的影響[J]. 植物學報， 2010， 45（3）：354-362.

[8]Duan B B， Ma Y H， Jiang M R， et al. Improvement of photosynthesis in rice （Oryza sativa L.） as a result of an increase in stomatal aperture and density by exogenous hydrogen sulfide treatment[J]. Plant Growth Regulation， 2015，75（1）：33-44.

[9]朱會朋， 孫健， 趙楠， 等. 鹽脅迫下硫化氫調控楊樹根系的離子流[J]. 植物生理學報， 2013， 49（6）：561-567.

[10]王鴻蕉， 張麗萍， 劉志強， 等. 外源硫化氫對冷脅迫下白菜幼苗生長和光合作用的影響[J]. 西北植物學報， 2015， 35（4）：780-786.

[11]Chen X D， Chen Q， Zhang X M， et al. Hydrogen sulfide mediates nicotine biosynthesis in tobacco （Nicotiana tabacum） under high temperature conditions[J]. Plant Physiol. Biochem.， 2016，104：174-179.

[12]單長卷， 趙元增. 外源硫化氫對干旱脅迫下玉米幼苗水分生理特性的影響[J]. 干旱地區農業研究， 2015， 33（5）：80-84， 231.

[13]田雲， 蔣景龍， 李麗， 等. 信號分子硫化氫調控植物抗逆性研究進展[J]. 核農學報， 2017， 31（11）：2279-2287.

[14]閔雄， 周志豪， 李忠光. 信號分子硫化氫的代謝及其在植物耐熱性形成中的作用[J]. 植物生理學報， 2016， 52（1）： 37-46.

[15]Szabó C. Hydrogen sulphide and its therapeutic potential[J]. Nat. Rev. Drug Discov.， 2007， 6（11）： 917-935.

[16]牟雪姣， 張遠兵， 吳燕， 等. 外源H2S緩解黃瓜種子萌發過程中干旱脅迫傷害的生理機制[J].西北農業學報， 2018， 27（9）：1328-1334.

[17]Chen J， Shang Y T， Wang W H， et al. Hydrogen sulfide-mediated polyamines and sugar changes are involved in hydrogen sulfide-induced drought tolerance in Spinacia oleracea seedlings[J]. Front. Plant Sci.， 2016， 7：1173.

[18]田壽樂， 沈廣寧， 許林， 等. 不同節水灌溉方式對干旱山地板栗生長結實的影響[J]. 應用生態學報， 2012， 23（3）：639-644.

[19]Ahmed B C， Rouina B B， Sensoy S， et al. Changes in gas exchange， proline accumulation and antioxidative enzyme activities in three olive cultivars under contrasting water availability regimes[J]. Environmental and Experimental Botany， 2009， 67（2）：345-352.

[20]賴金莉， 李欣欣， 薛磊， 等. 植物抗旱性研究進展[J]. 江蘇農業科學， 2018， 46（17）：23-27.

[21]薛鑫， 張芊， 吳金霞. 植物體內活性氧的研究及其在植物抗逆方面的應用[J]. 生物技術通報， 2013（10）：6-11.

[22]Beligni M V， Lamattina L. Nitric oxide stimulates seed germination and deetiolation， and inhibits hypocotyl elongation， three light-inducible responses in plants[J]. Planta， 2000， 210（2）：215-221.

[23]黃菡， 郭莎莎， 陳良超， 等. 外源硫化氫對鹽脅迫下茶樹抗氧化特性的影響[J]. 植物生理學報， 2017， 53（3）：497-504.

[24]Cui W， Chen H， Zhu K， et al. Cadmium-induced hydrogen sulfide synthesis is involved in cadmium tolerance in Medicago sativa by reestablishment of reduced （homo）glutathione and reactive oxygen species homeostases[J]. PLoS ONE， 2014， 9 （10）： e109669.

[25]孟丹， 劉玲， 陳露， 等. 外源硫化氫對鋁脅迫下水稻幼苗生長及生理生化的影響[J]. 江蘇農業科學， 2014， 42（6）：63-67.

[26]Li L， Wang Y Q， Shen W B. Roles of hydrogen sulfide and nitric oxide in the alleviation of cadmium-induced oxidative damage in alfalfa seedling roots[J]. Biometals， 2012， 25： 617-631.

[27]史程圓. 硫化氫在大豆抗旱適應中的保護作用[D]. 北京：中央民族大學， 2012.

[28]李永生， 方永豐， 李玥， 等. 外源硫化氫對PEG模擬干旱脅迫下玉米種子萌發及幼苗生長的影響[J]. 核農學報， 2016， 30（4）：813-821.

[29]謝志玉， 張文輝， 劉新成. 干旱脅迫對文冠果幼苗的生長和生理生化特征的影響[J]. 西北植物學報， 2010， 30（5）：948-954.

[30]姜英淑， 陳書明， 王秋玉， 等.干旱脅迫對2個歐李種源生理特征的影響[J]. 林業科學， 2009， 45（6）：6-10.

[31]Per T S， Khan N A， Reddy P S， et al. Approaches in modulating proline metabolism in plants for salt and drought stress tolerance： phytohormones， mineral nutrients and transgenics[J]. Plant Physiol. Biochem.， 2017， 115： 126-140.

[32]Wu S， Hu C， Tan Q， et al. Drought stress tolerance mediated by zinc-induced antioxidative defense and osmotic adjustment in cotton （Gossypium hirsutum）[J]. Acta Physiol. Plant.， 2015， 37（8）： 167-175.

[33]趙敏， 趙啟安， 劉博， 等. H2S對干旱脅迫下高山離子芥的作用研究[J]. 植物研究， 2018， 38（6）：902-912.

收稿日期：2019-05-28

基金項目：山東省農業良種工程項目（2016LZGC012）;山東省農業科學院青年科研基金項目（2016YQN29）;山東省農業科學院農業科技創新工程項目（CXGC2018F03，CXGC2018E22，CXGC2016A03）;山東省林業科技創新項目（LYCX05-2018-27）

作者簡介：孫曉莉（1986—），女，碩士，研究實習員，主要從事板栗栽培育種研究。E-mail：runxiaoli@163.com

通訊作者：沈廣寧（1979—），男，碩士，副研究員，主要從事板栗育種研究。E-mail： gnshens@163.com