黃芪多糖提高腦卒中后抑郁模型大鼠學(xué)習(xí)能力的實(shí)驗(yàn)觀察

王元元, 鄧衛(wèi)平, 李曉強(qiáng), 彭吉霞

(1. 十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)部)；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院； 十堰442000)

腦卒中后抑郁 (post-stroke depression，PSD)作為一種繼發(fā)于腦卒中后的心理障礙性疾病, 具有發(fā)生率、致殘率和病死率高的特點(diǎn)，患者的核心癥狀表現(xiàn)為疲勞、淡漠、興趣減退、情緒低落、反應(yīng)遲鈍及睡眠障礙等為主的心境障礙癥狀[1]。研究[2]表明，腦卒中病灶以丘腦、海馬損傷為主，顳葉、額葉及基底節(jié)受損次之。對(duì)其治療過程常伴有不同程度的腦缺血再灌注損傷，其中過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)表達(dá)與腦缺血再灌注損傷后應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，其水平與PSD有一定的相關(guān)性[3]。另有研究[4]表明，PSD的發(fā)生與腦海馬組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)信號(hào)通路活性有關(guān)。NF-κB信號(hào)通路在腦缺血神經(jīng)損傷可塑性方面發(fā)揮著重要的作用，抑制NF-κB活性可減輕缺血性腦卒中大鼠抑郁癥狀[5]。也有研究[6]表明, 抑郁的嚴(yán)重程度與腦區(qū)的腦電振蕩電位相關(guān), 海馬CA1區(qū)自發(fā)性動(dòng)作電位 (AP)和群峰電位(PS)電位降低, PSD抑郁癥狀明顯好轉(zhuǎn)。蒲榮等[7]研究表明, 針刺可顯著降低慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠前額葉皮層NF-κB。由此可見，NF-κB信號(hào)通路的活性及腦電振蕩電位與抑郁的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，抑制NF-κB信號(hào)通路的活性、降低AP和PS電位、糾正腦海馬CA1區(qū)異常電位可能有利于PSD的康復(fù)?；谶@一設(shè)想，本研究以PSD模型大鼠為研究對(duì)象，研究黃芪多糖對(duì)NF-κB信號(hào)通路及海馬CA1區(qū)AP和PS電位的影響，分析其對(duì)PSD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及抑郁樣行為的影響，為開發(fā)新藥用于臨床治療PSD提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量(180±10) g, 大鼠由十堰市太和醫(yī)院生命科學(xué)研究所提供[SCXK(鄂)2018-001]，在中心標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn) [SYXK(鄂)2018-001]，隨機(jī)均分為假手術(shù)組、抑郁模型組、黃芪多糖低劑量組(200 mg/kg)和高劑量組(400 mg/kg)，每組12只。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，遵守3 R原則，在造模和后期干預(yù)性治療期間給予動(dòng)物人道關(guān)懷，使之充分享受動(dòng)物福利。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水和進(jìn)食，自然光照、保持墊料干燥、動(dòng)物房恒溫(22～24 ℃)恒濕(50%～75%)。

1.2 主要藥品及設(shè)備

ZH-OM型O迷宮(Zero迷宮)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)； Anymaze分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)； 黃芪多糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司； 麻醉用水合氯醛購(gòu)自武漢博菜特化工有限公司； PP-83型玻璃電極拉制儀購(gòu)自日本Narishige 公司； Bio-Rad酶聯(lián)檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司； 振動(dòng)切片機(jī)和膜片鉗放大器均購(gòu)自英國(guó)Campden公司； NF-κB和PPAR-γ試劑盒購(gòu)自上海超研生物科技有限公司(批號(hào)： H1107、H1093)； 白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均由上海信裕生物科技有限公司提供(批號(hào)： H5034、H5037)。

1.3 PSD模型構(gòu)建方法及分組

實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周, 術(shù)前禁食不禁水。除假手術(shù)組12只外, 抑郁模型組、黃芪多糖低劑量組和高劑量組共36只大鼠，用水合氯醛腹腔注射麻醉, 腹部向上仰位固定大鼠, 剃去頸部被毛, 皮膚用碘伏消毒后鋪無(wú)菌巾, 切開皮膚, 用玻璃分針分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，從頸總動(dòng)脈(CCA)分叉處插入4-0尼龍線，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)進(jìn)入大腦中動(dòng)脈(MCA), 阻斷MCA血供2 h，然后將尼龍線拔出再灌注制備大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型[8]。在建立MCAO模型的基礎(chǔ)上，所有大鼠均單籠孤養(yǎng)，并于造模1周后，每日給予一次慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS), 連續(xù)刺激3周以構(gòu)建PSD模型。具體方法： 按禁食禁水24 h、4 ℃冰水游泳5 min、45 ℃烤箱烘烤5 min、夾尾1 min、水平高速振蕩30 min、燈光照射使之活動(dòng)晝夜顛倒等順序交替進(jìn)行應(yīng)激性刺激[9]。

1.4 干預(yù)方法

參考人與動(dòng)物間藥物劑量的換算方法，經(jīng)計(jì)算，大鼠每日用藥劑量在200～400 mg。實(shí)驗(yàn)人員預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，這一劑量對(duì)PSD模型大鼠均產(chǎn)生治療作用，故正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，黃芪多糖低劑量組(200 mg/kg)和高劑量組(400 mg/kg)大鼠用相應(yīng)劑量的黃芪多糖灌胃(1次/d)，在成功建立PSD模型后灌胃給藥治療 4 周。抑郁模型組和假手術(shù)組給予相同體積的生理鹽水灌胃對(duì)照。

1.5 PSD模型大鼠學(xué)習(xí)能力及行為學(xué)記錄

采用糖水?dāng)z取實(shí)驗(yàn)及Zero水迷宮分析系統(tǒng)評(píng)價(jià)大鼠抑郁樣行為及學(xué)習(xí)記憶能力[10]。

1.6 腦電振蕩電位膜片鉗記錄

大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后處死, 去頭頂骨暴露腦組織，迅速取出后放入4 ℃通有體積分?jǐn)?shù)95%O2+5%CO2的飽和人工腦脊液中, 分離出大鼠海馬CA1區(qū)腦組織，修整后用振動(dòng)切片機(jī)切成厚約300 μm的腦薄片。取其中2片于飽和人工腦脊液中孵育 1 h, 用膜片鉗放大器記錄海馬CA1區(qū)動(dòng)作電位(AP)、群峰電位(PS)。

1.7 IL-1β、IL-6的ELISA試驗(yàn)

處死大鼠前取尾靜脈血, 嚴(yán)格按ELISA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作, 檢測(cè)出IL-1β、IL-6濃度。

1.8 CA1區(qū)海馬腦薄片NF-κB和PPAR-γ蛋白表達(dá)

NF-κB和PPAR-γ蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blotting方法[12]。取未做膜片鉗的全部大鼠海馬CA1區(qū)腦組織制成組織勻漿液, 嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)上述標(biāo)本中NF-κB和PPAR-γ的吸光度(A)值，然后以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)、A值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 使用curve expert 1.3軟件計(jì)算出二者相應(yīng)濃度。

1.9 RT-PCR

采用實(shí)時(shí)定量-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)腦組織 NF-κB 和 PPAR-γ基因表達(dá)[13]。

NF-κB mRNA

上游引物： 5'- AGCCAGTGGAACTGCATGGTAC-3'，

下游引物： 5'- GCTAGCCCTGCTAGCTGAG-3'，

PPAR-γ mRNA

上游引物： 5'- ACCGACTAAGCGTTCATCTTAC-3'，

下游引物： 5'- AGCACTGGCCTCATCTGAC-3'，

GAPDH引物： 5'- AGCTCCGATCGGTCCGATTCAG-3'，

RNA 抽提試劑盒提取腦組織標(biāo)本總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄，以GAPDH為內(nèi)參PCR擴(kuò)增，然后對(duì)NF-κB和PPAR-γ基因進(jìn)行半定量分析。PCR反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性2 min，然后95 ℃和52 ℃各30 s、72 ℃ 60 s, 擴(kuò)增54個(gè)循環(huán)。以NF-κB和PPAR-γ灰度值/GAPDH灰度值表示NF-κB mRNA和PPAR-γ mRNA的相對(duì)值(/GAPDH)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，定量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Zero水迷宮及糖水?dāng)z取

與假手術(shù)組比, 抑郁模型組大鼠糖水?dāng)z取量明顯下降、逃避潛伏期延長(zhǎng), 越臺(tái)次數(shù)減少(P＜0.05)。與抑郁模型組比，低劑量組和高劑量組大鼠糖水?dāng)z取量明顯增多、逃避潛伏期縮短，越臺(tái)次數(shù)增多(P＜0.05)，且高劑量組與低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表 1)。

2.2 大鼠CA1區(qū)海馬腦電振蕩電位變化

與假手術(shù)組比，抑郁模型組海馬CA1區(qū)AP和PS膜電壓明顯升高(P＜0.05)。與抑郁模型組比較，低劑量組和高劑量組 CA1區(qū)AP和PS膜電壓明顯降低(P＜0.05)。高劑量組較低劑量組變化更明顯(P＜0.05)(表 2)。

表1 4組大鼠Zero水迷宮及糖水?dāng)z取實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表2 大鼠CA1區(qū)海馬AP和PS比較 mV

2.3 黃芪多糖對(duì)大鼠血清IL-1β、IL-6濃度影響

與假手術(shù)組比, 抑郁模型組血清IL-1β和IL-6明顯升高(P＜0.05)； 與抑郁模型組比較，低劑量組和高劑量組血清IL-1β和IL-6明顯降低(P＜0.05)；高劑量組降低更明顯(P＜0.05)(表3)。

表3 大鼠血清IL-1β、IL-6濃度比較 ng/L

2.4 黃芪多糖對(duì)大鼠腦組織NF-κB和PPAR-γ蛋白及其基因表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比，抑郁模型組NF-κB蛋白和NF-κB mRNA表達(dá)明顯升高，而PPAR-γ蛋白和PPAR-γ mRNA明顯降低(P＜0.05)。與抑郁模型組和低劑量組比較，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示高劑量組PPAR-γ蛋白及PPAR-γ mRNA高表達(dá)、NF-κB 蛋白及NF-κB mRNA 低表達(dá)(P＜0.05)。高劑量組與低劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表 4)。

3 討論

PSD是缺血性卒中后最常見的精神病并發(fā)癥，研究[14]表明，腦卒中2周后27.47%的患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的抑郁，PSD會(huì)延遲卒中后神經(jīng)功能的恢復(fù)，并可能增加卒中復(fù)發(fā)率和病死率。目前對(duì)其病理生理學(xué)的研究比較深入，但其發(fā)病機(jī)制仍然難以捉摸，似乎是多因素的，而不是“純粹的”心理社會(huì)學(xué)或生物學(xué)改變引起的，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí), MCAO后創(chuàng)傷性應(yīng)激可能是造成動(dòng)物抑郁的主要因素[15]。在PSD病理進(jìn)程中，存在NF-κB高激活現(xiàn)象，NF-κB信號(hào)通路是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要體系，是能將信息從胞質(zhì)傳至髓核引起相應(yīng)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，主要介導(dǎo)機(jī)體組織損傷、細(xì)胞分化和凋亡、創(chuàng)傷性應(yīng)激和防御反應(yīng)的信息傳遞，在缺血性腦卒中與血管壁炎癥損傷中發(fā)揮著重要作用[16]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時(shí), 處于高激活狀態(tài)的NF-κB誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)一系列趨化因子及黏附分子, 侵入血管內(nèi)膜形成泡沫細(xì)胞, 加速血管形成, 并進(jìn)一步激活外周血單核細(xì)胞, 誘導(dǎo)產(chǎn)生和釋放細(xì)胞因子IL-1β、IL-6等, 刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并加重腦損傷[17]。有研究[18]表明, IL-6作為一種重要的炎癥介質(zhì), 介導(dǎo)PSD病理演變過程中的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其表達(dá)水平與腦損傷程度呈正相關(guān), 而腦損傷程度又與抑郁程度正相關(guān)。PPAR-γ具有清除分子氧和氫過氧化物等作用。同時(shí)，PPAR-γ可促進(jìn)NF-κB的磷酸化反應(yīng), 從而抑制其活性，因PPAR-γ激活后可以抑制缺血再灌注損傷腦組織及血管中炎性細(xì)胞的免疫活性, 且PPAR-γ對(duì)巨噬細(xì)胞活化起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子IL-1β、IL-2、IL-6等, 從而實(shí)現(xiàn)缺血缺氧后對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)[19]。因此，有理由相信, NF-κB信號(hào)通路在PSD的病理演變中具有重要的信號(hào)轉(zhuǎn)錄作用。調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，提高PPAR-γ活性、抑制NF-κB信號(hào)通路的激活可減少IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子的釋放，可降低腦組織炎癥反應(yīng)造成的腦損傷，在一定程度上降低腦卒中后抑郁的發(fā)生和發(fā)展。

表4 大鼠NF-κB和PPAR-γ蛋白及其基因表達(dá)比較

黃芪多糖除具有抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫和降血糖等藥理學(xué)活性外, 還具有良好的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)功能恢復(fù)作用, 對(duì)改善神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病引起的不同類型的神經(jīng)損傷具有明顯治療作用[20]。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn), 在干預(yù)性治療4周后, 黃芪多糖低劑量組和高劑量組大鼠NF-κB蛋白和NF-κB mRNA表達(dá)均明顯降低, 而PPAR-γ蛋白和PPAR-γ mRNA明顯升高，且血清IL-1β和IL-6明顯降低。由此可見，黃芪多糖可能通過提高PPAR-γ活性來(lái)抑制NF-κB信號(hào)通路活性。NF-κB信號(hào)通路活性降低又會(huì)引起受其調(diào)控的IL-1β、IL-6的釋放減少, 這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)降低腦組織炎癥反應(yīng)造成的腦損傷, 減輕腦卒中后抑郁的發(fā)生起到重要的促進(jìn)作用。這一結(jié)果與上述諸多研究結(jié)論及王煜等[21]的研究結(jié)果高度一致。研究[22]表明，PSD會(huì)造成腦組織持續(xù)性缺血缺氧，這會(huì)導(dǎo)致鈉氫通道開放，鈉氫通道對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)pH值以及細(xì)胞體積穩(wěn)定至關(guān)重要。鈉氫通道過度激活和開放會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+超載，進(jìn)而激活鈉鈣通道，使Ca2+內(nèi)流增加，這又可能引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載并造成細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，Ca2+超載是引起PSD患者神經(jīng)細(xì)胞損傷的離子基礎(chǔ)。也是抑郁模型組大鼠CA1區(qū)海馬AP和PS膜電壓高于假手術(shù)組的離子基礎(chǔ)。從膜片鉗記錄結(jié)果看，黃芪多糖低劑量組和高劑量組CA1區(qū)AP和PS膜電壓較抑郁模型組低，黃芪多糖對(duì)離子通道和CA1區(qū)膜電位的影響還是首次發(fā)現(xiàn)，這一現(xiàn)象提示黃芪多糖具有維持膜電壓穩(wěn)定性的作用。黃芪多糖可能具促進(jìn)持續(xù)開放的鈉氫通道關(guān)閉，使Na+、H+交換和Na+、Ca2+維持在正常水平，保證細(xì)胞內(nèi)pH值和Ca2+水平的平衡，防止細(xì)胞酸中毒并糾正Ca2+超載，促使神經(jīng)細(xì)胞功能得以恢復(fù)。黃芪多糖低劑量組和高劑量組大鼠糖水?dāng)z取量明顯增多、逃避潛伏期縮短,越臺(tái)次數(shù)增多，這一現(xiàn)象提示經(jīng)黃芪多糖治療,大鼠抑郁樣行為減輕，學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，黃芪多糖可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活而降低受其調(diào)控的細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的釋放，減輕炎癥反應(yīng)并提高CA1區(qū)膜穩(wěn)定性，這可能是其治療PSD的機(jī)制之一。

前已述及，PSD引起的抑郁樣行為與CA1區(qū)海馬AP和PS膜電壓穩(wěn)定性有關(guān)，本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于在觀察黃芪多糖對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響的同時(shí)、結(jié)合電生理技術(shù)記錄其對(duì)離子通道和CA1區(qū)膜電壓的影響并系統(tǒng)分析了可能機(jī)制，為其在醫(yī)藥保健等領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用方面提供參考，也為研究其它藥物治療PSD提供了可行的研究方法。但PSD是一種“多機(jī)制、多因素”的精神病并發(fā)癥，本研究雖從行為、電生理、生化檢測(cè)和分子生物學(xué)等方面觀察黃芪多糖對(duì)PSD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及抑郁樣行為的影響，但也有不足之處，如未觀察MCAO后創(chuàng)傷性應(yīng)激引起抑郁癥狀有關(guān)的5-羥色胺水平及與機(jī)體興奮性有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)腎上腺素(Adr)和去甲腎上腺素(NE)水平， 也未觀察與神經(jīng)恢復(fù)相關(guān)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)蛋白等，并且本實(shí)驗(yàn)是在建立PSD模型后給藥治療，而不是在MCAO后和CUMS期間進(jìn)行預(yù)防性給藥進(jìn)行干預(yù)性治療，這不能完全反映黃芪多糖在PSD病理演變過程中的作用，故還不能完全揭示黃芪多糖對(duì)PSD的全部可能機(jī)制，這也是我們下一步工作的重點(diǎn)。