神經壞死病毒疫苗免疫后3種免疫相關基因在斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)組織中的表達研究

朱志煌，林建偉

(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

石斑魚是目前海水養殖魚類中的高檔優質魚類。隨著我國石斑魚人工育苗技術的成熟，斜帶石斑魚苗種產業化得到大規模的發展，其已成為重要的海水魚類養殖品種。但這幾年石斑魚苗種期頻繁發生病毒性疾病，引發苗種大量死亡[1]。國內已經報道的能引起養殖石斑魚患病的病毒主要是諾達病毒科和虹彩病毒科兩類病毒。魚類病毒性神經壞死癥又叫病毒性腦病和視網膜病(Viral encephalopathy and retinopathy，VER)，它是由諾達病毒科的神經壞死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)感染所引起，作為世界動物衛生組織(Office International Des Epizooties，OIE) 必報的傳染病之一，日益受到國內外重視[2]。

魚類的免疫系統具有排除異己的功能。在病毒感染過程中，病毒抗原異物會引起魚類機體產生一系列的免疫應答，最終依靠免疫系統來識別并消滅入侵的病原體。魚類雖然是較為古老和已知兼具固有與獲得性免疫的最低等脊椎動物，但仍然還是進化最成功及最具多樣化的脊椎動物群體[3]。由于魚類屬于變溫動物，其淋巴細胞的增殖較為緩慢，獲得性免疫應答的發生相對滯后且應答效能較低，且其免疫系統受特殊環境條件的制約。因此，相比于哺乳類，魚類的先天性免疫系統在抵抗病原體感染的免疫應答中發揮更為重要的作用[4]。

干擾素(Interferon，IFN) 是先天免疫系統中主要的抗病毒防御與調節因子，具有廣譜抗病毒特點。它并不直接殺傷或抑制病毒，而是通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復制。機體在早期的病毒感染期間，干擾素即可控制病毒的生長和增殖。它一方面直接激活免疫細胞，另一方面可間接抑制病毒的復制過程[5]。腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種由巨噬細胞產生的細胞因子，它能抑制病毒介導的細胞病變的發展，對RNA病毒和DNA病毒均有抑制作用。除誘導未感染細胞具有抗病毒能力之外，TNF-α也可選擇性殺傷病毒感染的細胞[6]。干擾素調節因子3(Interferon regulatory factor 3，IRF3)是干擾素調節因子家族成員之一，與病毒感染時干擾素基因的表達密切相關，IRF3在多種細胞中均有表達，但主要存在于細胞漿中。病毒感染可誘導IRF3與其他轉錄因子結合，誘導IFNα/β和IFN基因的表達，在抗病毒感染的免疫過程中發揮重要作用[7]。

隨著斜帶石斑魚養殖業的迅猛發展，由神經壞死病毒造成的病毒性神經壞死病日益嚴重，已成為石斑魚產業發展所面臨的一個重要制約因素[8]。目前，針對斜帶石斑魚在抗神經壞死病毒免疫機理的研究還不夠深入且缺乏系統性。本項目利用基因工程手段生產出的神經壞死病毒亞單位疫苗(Virus-like particles，VLPs)代替傳統的人工減毒、滅活疫苗，并以斜帶石斑魚為研究對象進行肌肉注射實驗，開展斜帶石斑魚疫苗免疫過程中3種主要的抗病毒因子(IFN、TNF-α和IRF3)的差異表達研究。通過RNA提取、逆轉錄和實時熒光定量等技術對免疫后石斑魚9種組織中的抗病毒基因進行表達譜差異研究，分析了IFN、TNF-α和IRF3基因的調控及作用機理，從而深入了解斜帶石斑魚抗神經壞死病毒免疫防御機制，為良種培育提供分子基礎，同時促進石斑魚產業的健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料

健康的斜帶石斑魚樣品取自廈門小嶝水產有限公司，其平均體重為10 g，在自然光周期下，石斑魚被散養在外界溫度為25℃的充氣池中。經過一周的環境適應后，挑選健康個體進行疫苗免疫實驗。

1.2 疫苗免疫實驗和取樣

實驗魚隨機分為3組(對照組、疫苗組及佐劑+疫苗組)，每組包含35條魚，體長為(6.10 ± 0.34) cm，體重為(10.07 ± 0.79) g。對照組每尾魚注射50 μL的PBS溶液。疫苗組每尾魚按每g魚體重肌肉注射2 μg的VLPs蛋白，注射包含20.14 μg VLPs蛋白的PBS溶液50 μL。佐劑+疫苗組每尾魚注射包含0.14 μg/μL濃度CpG寡核苷酸佐劑和總量為20.14 μg VLPs蛋白的PBS溶液50 μL(表1)。在免疫后的0、4、8、12、16、24、32、48、72 h，取實驗組和對照組的石斑魚(每個時段每組3條魚)，解剖獲得肝臟、脾臟、腎臟、腸、眼、腦、血、心臟和鰓共9個組織的樣本，迅速投入液氮中速凍，于-80℃冰箱中保存。

1.3 RNA 提取和 cDNA 的合成

采用 Invitrogen 公司的 Trizol 試劑盒，按照說明書提取樣本組織總RNA。利用QuantScript RT Kit并按照說明書來合成cDNA，提取的樣品保存在-20℃條件下以備后續使用。

1.4 引物設計和實時熒光定量實驗

根據NCBI網站上已公布的魚類IFN、TNF-α和IRF3基因序列保守區設計引物，用來做定量分析(表1)。用熒光定量 PCR 的方法來檢測3個免疫相關基因在健康斜帶石斑魚個體的不同組織中的表達情況，及其在免疫后肝臟、脾臟和腎臟中的表達情況。通過 β-Actin(β-Actin-F/R，表1) 的表達量，將對照組和實驗組個體在不同時間點的表達量進行校正，以消除不同個體對實驗結果的影響。再將這些校正后的表達量與最初未感染時間點(0 h) 的表達量比較，分析各基因在健康個體組織，以及在疫苗免疫后的倍數變化，分析基因在免疫應激后的表達規律。熒光定量PCR的反應條件為95℃預變性10 s，40個循環中95℃變性5 s，60℃退火34 s。

表 1 本研究中所使用的引物Tab.1 The sequences of primers used in this study

1.5 統計學分析

2 結果與分析

2.1 3種免疫相關基因在斜帶石斑魚9種組織中的表達情況

IFN、TNF-α和IRF3基因在斜帶石斑魚的9組織中都有表達(心、肝、脾、腎、腸、鰓、血、眼和腦)，但是各組織的表達量有所不同(圖1)。IFN基因在9組織中表達量高低順序為：腦>鰓>腎>脾>血>眼>肝>腸>心，IFN基因在斜帶石斑魚腦中的相對表達量是心臟中的319倍。TNF-α基因在斜帶石斑魚鰓和腦中的表達量較高，與其他組具有明顯的統計學差異(P<0.05)， TNF-α基因在斜帶石斑魚鰓中的相對表達量是心臟中的47倍。IRF3基因在斜帶石斑魚血液中的表達量最高，在脾臟、鰓、眼睛、腎臟和肝臟中的表達量次之，而在腦、腸和心臟的表達量最少，血液中IRF3基因的相對表達量是心臟的61倍。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note：Values with different superscripts were significantly different(P<0.05).

2.2 疫苗免疫后3種免疫相關基因在斜帶石斑魚肝臟中的表達情況

在肝臟中，單獨疫苗免疫并沒有提高IFN、TNF-α和IRF3基因的相對表達量，但是在注射添加佐劑的疫苗后，這3種基因的相對表達量都出現明顯的上調，其中IFN基因在免疫8 h處達到最高表達值，而TNF-α基因和IRF3基因的表達高峰均出現在免疫4 h處(圖2)。

注：“*”號表示實驗組與對照組差異顯著。下圖同此。
Notes：Datas indicated with asterisk symbol(*) were significantly different(P<0.05) between challenged group and control group.The same as below.

2.3 疫苗免疫后3種免疫相關基因在斜帶石斑魚脾臟中的表達情況

在脾臟中，單獨疫苗免疫后，IFN基因的相對表達量沒有提高，而在佐劑+疫苗組中IFN基因表達量出現上調，在免疫48 h處出現表達高峰。在疫苗組中TNF-α基因的表達量在免疫刺激4 h處達到最高值；而在佐劑+疫苗組免疫刺激4 h處TNF-α基因的表達量明顯高于疫苗組，且在免疫刺激72 h處TNF-α基因的表達量達到最高。IRF3基因在疫苗組和佐劑+疫苗組中的表達模式相近，均在免疫刺激4 h時迅速達到表達最高峰，然后表達逐漸回落，之后在免疫刺激48 h處出現第二表達高峰，最后恢復到正常表達水平(圖3)。

2.4 疫苗免疫后3種免疫相關基因在斜帶石斑魚腎臟中的表達情況

在腎臟中，單獨疫苗免疫后，IFN基因的相對表達量沒有提高，而在佐劑+疫苗組中IFN基因在免疫后表達量出現上調，在免疫刺激48 h后表達量最高。在免疫刺激后，TNF-α基因在疫苗組和佐劑+疫苗組中的表達量都有出現增高的現象，且最高的基因表達量均出現在免疫刺激16 h處，同時佐劑+疫苗組中TNF-α基因的最高表達量明顯大于疫苗組。在免疫刺激后，疫苗組和佐劑+疫苗組中的IRF3基因表達量出現一定的波動變化，但均在免疫刺激48 h后達到最高表達量，之后迅速回落到較為正常的表達水平，同時佐劑+疫苗組中IRF3基因的最高表達量也明顯大于疫苗組(圖4)。

3 討論

斜帶石斑魚是福建省沿海養殖的重要經濟品種之一，近年來其養殖規模迅速壯大。由于養殖戶過度追求經濟效益，導致他們盲目追求高養殖密度高產量，從而引發養殖品種常常出現暴發性死亡現象，極大地制約了我國石斑魚養殖業的健康持續發展[9-12]。在斜帶石斑魚眾多病害中，病毒病是最難治療的一類疾病，主要還是以預防為主，至今尚無理想的治療方法[13]。

魚類病毒性神經壞死病(Viral nervous necrosis，VNN)的致病原為諾達病毒科(Nodaviridae)，β諾達病毒屬(Betanodavirus)的神經壞死病毒(NNV)。根據NNV基因組RNA2編碼序列的差異，可將NNV分為赤點石斑神經壞死病毒(RGNNV)、紅鰭東方鲀神經壞死病毒(TPNNV)、條斑星鰈神經壞死病毒(BFNNV)和擬鲹神經壞死病毒(SJNNV)四種基因型[14-15]。感染斜帶石斑魚的神經壞死病毒主要為RGNNV，其具有極高的傳染性并對仔魚和幼魚危害極大，受感染嚴重者在一周內死亡率可達100%，且目前仍無有效的免疫防治方法[8]。因此，研制高效的抗病毒藥物來提高魚體免疫能力，從而有效防止VNN爆發顯得尤為重要。

有研究通過實時熒光定量法檢測發現金魚和南亞野鯪IFN基因在其脾臟中的表達量均高于其他組織[16-17]；鯉IFN基因在其腸道和鰓中的表達量最高[18]；大西洋鱈IFN基因在其鰓和脾臟中表達量最高[19]；日本鰻鱺IFN基因在其肝臟中的轉錄表達水平最高[5]。TNF-α基因在健康香魚各大組織中均有不同程度的表達，且在頭、腎中的表達量最高[6]。研究太平洋鱈魚發現IRF3基因在其性腺中的表達量顯著高于其他組織[7]。本研究發現IFN、TNF-α和IRF3這3種免疫相關基因在石斑魚9種組織中均有表達，且均在斜帶石斑魚心臟中表達量最少，但是表達模式仍然不盡相同。

佐劑是一種先于抗原或與其同時使用的物質，可增強機體非特異性免疫反應，僅使用少量抗原即可達到理想的免疫效果，配比合適的疫苗佐劑可有效提高疫苗的保護力。鄭風榮等[20]研究發現，細菌中和人工合成的CpG 寡核苷酸基序可激活免疫活性細胞，從而產生多種細胞因子，增強機體的非特異性和特異性免疫，是一種高效、安全、新型的免疫佐劑。Jorgensen等[21]利用DNA疫苗和人工合成的CpG 寡核苷酸基序體外刺激大西洋鮭魚，經過48 h反應后，在其細胞培養上清液中檢測到了抗病毒活性物質。本研究通過免疫注射實驗，發現單獨使用疫苗并沒有提高肝臟中IFN、TNF-α和IRF3基因，以及脾臟和腎臟中IFN基因的表達量，然而在疫苗中添加CpG 寡核苷酸基序佐劑進行注射后，IFN、TNF-α和IRF3基因的表達量均出現顯著的提高；而在疫苗組其他組別中，這3種免疫相關基因的表達量在疫苗刺激后都有所上調，但是其最高表達量都明顯小于所對應的佐劑+疫苗組，表明CpG寡核苷酸基序可以大幅度提高疫苗的免疫原性和機體的免疫反應能力，從而使疫苗發揮最大的免疫作用[22-23]。