脂質體方法用于modRNA 轉染各種類型細胞的初步研究

顏冰倩 王會景 艾雪峰 宮藝其 譚瑤 徐徐 王偉 付煒

化學合成修飾信使核糖核酸（Chemically Synthetic Modified Message RNA，modRNA）是一種新興的基因表達載體。因mRNA 在傳遞遺傳信息、翻譯目的蛋白過程中的獨特作用，該技術通過對體外合成的mRNA 進行堿基修飾替換和結構優化，進而逃避固有免疫應答，提高體內外的穩定性，并能夠在各種化學載體或物理方法的幫助下轉入細胞，最終實現在體內外高效、快速地表達所需蛋白的目的。與未修飾的mRNA 相比，modRNA 能夠抑制膜受體Toll樣受體（Toll-like Receptors，TLR）及胞內受體視黃酸誘導基因蛋白I（Retinoic Acid-Inducible Gene I，RIG I）的激活，避免機體固有免疫應答引起的細胞毒性及炎癥損傷等；同時，modRNA 能夠通過改變化學結構、抑制核酸酶的剪切等，提高mRNA 在體內外的穩定性，加強其翻譯表達蛋白的能力，解決了mRNA 臨床轉化中高免疫原性、低穩定性等瓶頸問題[1-2]，具有極大的應用前景。

與病毒、質粒、蛋白等表達載體相比，modRNA能實現快速、脈沖式地表達所需的目的蛋白，通常在24 h 左右達到高峰期，持續大約1～2 周，但不會引起基因組的改變，避免了不良的免疫應答，是一種安全、高效的基因表達載體[3-4]。研究發現，往小鼠心臟內直接注射成血管因子VEGF modRNA 能夠縮小梗死的范圍，優化心梗后的血供情況，提高心肌細胞的存活率，改善不良預后，在心梗治療中具有一定的作用[5]。此外，modRNA 在疾病中的療效也在大動物模型中得到了進一步的驗證[6]。然而，單純的modRNA裸注射，用量大、費用昂貴、效果欠佳，而且大量的modRNA 裸注射也容易導致細胞凋亡、炎癥反應等，限制了在臨床治療中的應用。因此，將modRNA 結合細胞進行治療，不但能大大減少modRNA 的用量，節約成本，避免不良的副反應，還能充分利用細胞這一載體的優勢，高效、安全、局部、短期地將mRNA 翻譯表達產生所需的蛋白遞送到目的組織中，以充分發揮其生物學療效[7]。因此，modRNA 結合細胞或許是一種理想的蛋白表達載體，能夠在臨床轉化中表現出更大的優勢。

隨著生物材料的不斷發展，mRNA 的轉染方式層出不窮，包括脂質體、高分子納米顆粒、魚精蛋白-mRNA 復合物、金納米顆粒、電穿孔等[8]。目前，脂質體轉染法因其高效、穩定、便于廣泛應用等優點，仍然是最常見的mRNA 轉染方法。本研究旨在篩選更優的modRNA 脂質體轉染試劑，探討將更優的脂質體轉染試劑用于modRNA 轉染各種類型細胞，并表達所需目的蛋白的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

RNAiMAX、MessageMax、Opti-MEM、0.25% EDTA/胰酶（Life Technologies，美國），高糖DMEM、PBS、雙抗（Hyclone，美國），FBS（Bioind，以色列），DMSO（Sigma，美國），DH5a 感受態細胞（天根生化科技有限公司），Xhol 酶、質粒小抽試劑盒、PCR 純化試劑盒、體外轉錄試劑盒、轉錄物純化試劑盒（Thermo，美國），TBX5 一抗（Proteintech，美國），驢抗兔IgG 二抗（Abcam，英國），DAPI（上海翊圣生物科技有限公司）。pUC57-GFP/pUC57-mCherry/pUC57-nGFP/pUC57-mTBX5 質粒及PCR 引物均訂購于上海桑尼生物科技有限公司。

流式細胞分析儀（FACSCantoTMFlow Cytometer，BD，美國），激光掃描共聚焦顯微鏡（TSC SP8，Leica，德國），倒置熒光顯微鏡（DMI3000B，Leica，德國），凝膠成像儀（Tanon-3500，上海天能科技有限公司），NanoDrop 2000（Thermo，美國）。

1.2 實驗動物

12.5d 的ICR 孕鼠1 只（上海南方模式生物科技股份有限公司），本實驗遵守實驗動物倫理原則。

1.3 實驗方法

1.3.1 質粒轉化、擴增、提取

取1 μg 質粒與20 μL DH5a 感受態細胞混勻后置于冰上，42 ℃熱激90 sec 后冰浴數分鐘，加入1 mL 無抗性LB 于37 ℃搖床上活化1 h，隨后取少許菌液涂于氨芐青霉素（Amp）抗性的LB 板上37 ℃倒置培養過夜。次日挑取白色單菌落加入Amp 抗性LB 培養液中，37 ℃搖床擴增過夜。參照質粒小抽試劑盒說明書提取純化質粒，凝膠電泳鑒定及nanodrop 鑒定。

1.3.2 modRNA 制備

用 Xhol 酶 對 pUC57 -GFP/pUC57 -mCherry/pUC57-nGFP/pUC57-mTBX5 質粒進行單酶切，參照PCR 純化試劑盒說明書對酶切產物進行純化，PCR擴增GFP/mCherry/nGFP/ mTBX5 的CDS 序列，再次純化后進行凝膠電泳及nanodrop 鑒定。以Anti Reverse Cap Analog、3＇-O-Me-m7G(5＇)ppp(5＇)G RNA Cap、N1-甲基假尿嘧啶（N1-methylpseudouridine，m1Ψ）、ATP、CTP、GTP 為原料進行體外轉錄，參照轉錄物純化試劑盒說明書對轉錄產物進行純化，隨后進行磷酸化處理并再次純化，nanodrop 鑒定，將modRNA 稀釋成1 μg/μL 于-80 ℃儲存。詳細步驟見參考文獻[6，9]。

GFP/mCherry/nGFP 的CDS 序列見參考文獻[5，10]，mTBX5 的CDS 序列見NM_011537.3。

1.3.3 MEF 細胞分離、提取

將12.5 d 的ICR 孕鼠處死，取出胚胎置于10 mm培養皿中，去除頭部、內臟、四肢，將剩余組織剪碎后加入3 mL 0.25%EDTA/胰酶，置于37 ℃培養箱中消化20 min，再加入3 mL 0.25% EDTA/胰酶，繼續消化20 min，用6 mL 高糖DMEM 培養液（含10%胎牛血清、1%雙抗）中止消化，充分混勻后靜置數分鐘，取上清離心5 min 后按合適密度種到10 mm 培養皿，次日PBS 清洗后換液，一般使用第2～4 代的MEF 細胞。

1.3.4 細胞培養、凍存

MEF 細胞、3T3 細胞、Hela 細胞、MCF-7 細胞均采用高糖DMEM 培養液（含10%胎牛血清、1%雙抗）培養，培養條件為37 ℃、5%CO2，每2～3 天換液，融合80%左右傳代。細胞凍存則均采用60%高糖DMEM 培養液+30%胎牛血清+10%DMSO 配制凍存液，凍存于液氮中。

1.3.5 轉染方法

將各類細胞以合適的細胞量接種至6 孔板中，70%～80%融合時進行轉染。EP 管A：將2 μg mod-RNA 混 于98 μL optimem 中；EP 管B：將5 μL RNAiMax 或MessageMax 混于95 μL optimem 中。室溫靜置5 min，A 管+B 管混勻，再室溫靜置15 min。同時，吸去6 孔板中的培養液，PBS 清洗后加入2 mL optimem，再將加入上述轉染混合液，搖勻。培養箱內孵育4～6 h，吸去optimem，換回培養液。24 孔板的轉染體系為6 孔板的1/4。

1.3.6 轉染效率及平均熒光強度（MFI）測定

轉染modGFP 后取合適時間點對細胞進行熒光顯微鏡觀察，PBS 清洗后消化細胞，使用流式細胞分析儀檢測GFP 陽性細胞比例和MFI。

1.3.7 免疫熒光

對于核內蛋白，MEF 細胞接種在24 孔細胞爬片上培養24 h 后進行modRNA 轉染，轉染24 h 后進行免疫熒光實驗。吸去培養液，PBS 清洗細胞3次，4%多聚甲醛固定20 min，0.5% Triton-100 破膜通透20 min，10%山羊血清室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，PBS 漂洗3 次，二抗室溫避光孵育2 h，PBS 漂洗3 次，DAPI 染5～10 min 后PBS 漂洗一次，封片后避光保存，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件（美國）進行統計分析，數據以（）表示，組間比較采用非配對t檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 modRNA 制備與鑒定

將pUC57-GFP/pUC57-mCherry/pUC57-nGFP/pUC57-mTBX5 質粒經限制性內切酶Xhol 單酶切后使得環形質粒線性化，采用特異性引物對GFP/mCherry/nGFP/mTBX5 CDS 序列進行PCR 擴增，隨后體外轉錄生成GFP/mCherry/nGFP/mTBX5 modRNA，對上述步驟的產物進行凝膠電泳鑒定（圖1）。

2.2 modGFP 轉染MEF，篩選更優的轉染試劑

當MEF 細胞融合達70%～80%，采用Message-Max 轉染modGFP 24 h 后，熒光顯微鏡下可以觀察到大部分MEF 細胞能夠翻譯表達綠色熒光蛋白（GFP），并對其進行流式細胞分析，發現MEF 細胞的轉染效率達（83.33%±3.23%）。而RNAiMax 24 h時modGFP 的轉染效率為（78.77%±6.12%），略低于MessageMax，但兩者沒有統計學差異。分別采用熒光顯微鏡和流式細胞分析儀記錄兩種轉染試劑轉染modGFP 后1 周MEF 細胞的蛋白表達情況，發現MessageMax 的平均熒光強度明顯高于RNAiMax，表明其翻譯表達GFP 的效率更高（圖2）。

2.3 modGFP 在不同其他種類細胞中的表達情況

為了驗證MessageMax 是否同樣適用于其他細胞系modRNA 的轉染實驗，采用MessageMax 將modGFP 分別轉染入3T3 細胞、Hela 細胞及MCF-7細胞，可以發現上述細胞均能快速、高效地翻譯和表達GFP，24 h 時的轉染效率分別為（76.67%±0.15%）、（93.33%±1.42%）、（77.30%±4.57%）。說明Message-Max 不但能夠實現原代細胞的高效轉染，如MEF 細胞，還能夠介導腫瘤細胞系及成纖維細胞系的mRNA轉染，應用范圍廣（圖3）。

2.4 兩種不同modRNA 共轉在細胞中的表達情況

為了驗證MessageMax 能否介導兩個甚至多個不同的modRNA 同時高效轉染，采用MessageMax將modGFP 和modmCherry 同時轉染入MEF 細胞中，24 h 后熒光顯微鏡觀察，可以發現大部分MEF細胞能夠同時翻譯表達GFP 和mCherry，共轉效率高。說明MessageMax 能夠實現同一細胞內多個因子的共同轉染，為基礎研究或臨床治療中多個modRNA的聯合應用奠定了基礎（圖4）。

2.5 核內因子的轉染及鑒定

為驗證MessageMax 能否順利實現核內蛋白的翻譯表達及精準定位，采用MessageMax 將modnGFP轉染入MEF 細胞24 h 后，發現添加核定位序列的GFP 能夠與DAPI 實現共染，很好地定位到了細胞核中。將轉錄因子mTBX5 modRNA 通過Message-Max 轉染到MEF 細胞中24 h 后，能夠發現轉錄因子在細胞核內的定位表達。說明MessageMax 作為一種良好的modRNA 轉染試劑，不但能應用于胞內蛋白的研究中，還能夠介導轉錄因子等多種核內蛋白的高效翻譯和表達，適用范圍廣（圖5）。

圖1 modRNA 制備過程中質粒、酶切、PCR、體外轉錄的鑒定結果Fig.1 Identification of plasmid,digested product,PCR product and IVT product during the preparation of modRNA

圖2 兩種modRNA 轉染試劑的轉染效率及蛋白表達強度Fig.2 Transfection efficiency and protein expression effects of two modRNA transfection reagents

圖3 modGFP 轉染3T3 細胞、Hela 細胞及MCF-7 細胞的熒光圖及流式分析Fig.3 Fluorescence image and flow cytometric analysis of 3T3 cells,Hela cells and MCF-7 cells after modGFP transfection

圖4 MEF 細胞共轉modGFP 和modmCherry 的熒光圖Fig.4 Co-transfection of modGFP and modmCherry into MEF cells

圖5 MEF 細胞轉染核內因子nGFP modRNA 和mTBX5 modRNA 的熒光鑒定Fig.5 Fluorescent analysis of nGFP modRNA and mTBX5 modRNA into MEF cells

3 討論

隨著對人類遺傳學的深入探索和對精準醫療的迫切需要，不論是疾病發生發展過程中機制方面的探究，還是基因缺陷性疾病的替代性治療，抑或是通過高表達某種蛋白來發揮旁分泌作用、調控細胞功能等，基因載體都扮演著一個越來越重要的角色，是基礎研究及臨床治療中不可或缺的一種手段。目前，主要的基因載體包括病毒、質粒、mRNA、蛋白等。傳統的病毒載體主要涉及安全性問題，不論是基因整合的風險還是病毒自身，在真正臨床應用中都不可避免受到各種質疑。質粒DNA 因轉染效率低和蛋白表達量少在應用中也受到一定的限制，而直接注射蛋白則存在著高免疫原性、半衰期短、價格昂貴等缺點。因此，modRNA 通過體外合成堿基修飾的信使核糖核酸，不僅改善了mRNA 應用過程中高免疫原性的不良反應，還提高了體內外的穩定性及翻譯表達效率，能夠實現所有目的蛋白在體內外高效、快速、脈沖式地表達，具有良好的臨床轉化價值[2-4，11]。

然而，modRNA 應用也面臨著瓶頸問題，比如：單純的modRNA 裸注射用量大，轉染效率不夠高，蛋白表達不夠強，費用昂貴，且modRNA 載體通常具有一定的毒性，大劑量轉染容易引起細胞凋亡或炎癥反應等，從而在某種程度上限制了該技術的進一步推廣及應用[7]。

因此，將modRNA 技術與細胞治療相結合，或許能夠取長補短，是一個極具應用價值的研究方向。一方面，細胞通過提供蛋白合成過程中的一系列化學物質和能量，使得modRNA 能夠快速、高效、脈沖式地翻譯表達目的蛋白，從而充分發揮基因載體的功能[12-14]。我們的方法是先體外利用modRNA 轉染細胞后，再利用細胞這個媒介進行基因研究或疾病治療，從而更高效地發揮modRNA 的功能。因此，篩選高效的modRNA 轉染試劑，并證實該轉染試劑能夠介導多種細胞、多種modRNA 的轉染表達多種蛋白，可為將來modRNA 的進一步應用奠定基礎。另一方面，modRNA 轉染細胞也能對細胞的生物學功能起到一定的調控作用，modRNA 不僅能夠利用細胞作為蛋白加工廠，生產目標蛋白，還能夠促進干細胞分化[5，15]、介導細胞轉分化、誘導細胞重編程等[16-17]。因此，篩選出高效的modRNA 轉染試劑十分重要，而該轉染試劑能夠介導多種modRNA 共轉表達多種蛋白或者介導核內蛋白modRNA 的轉染都是modRNA 充分發揮上述生物學功能的前提。

盡管針對mRNA 轉染的各種新型轉染方式和轉染試劑層出不窮，但陽離子脂質體仍是目前最主要的轉染載體。因此，本研究通過篩選更優的modRNA 的陽離子脂質體轉染試劑，探討是否能夠將其應用于多種類型細胞的轉染中，是否能夠實現包括轉錄因子在內所有的目的蛋白的翻譯表達，是否能夠實現多個因子的共同轉染和表達。

本研究通過轉染modGFP 比較了RNAiMax 及MessageMax 這兩種mRNA 轉染試劑的轉染效率和蛋白表達強度，經流式細胞儀、熒光顯微鏡分析，發現modGFP 轉染MEF 細胞后能夠快速、高效、脈沖式地表達綠色熒光蛋白，在12～24 h 達到峰值，并持續1 周以上；同時，與RNAiMax 相比，MessageMax雖然在轉染效率上沒有顯著提高，但是平均蛋白表達水平明顯增加，峰值上升，呈現更典型的“脈沖式”表達的曲線模式，是一種更優的modRNA 轉染試劑；并且，modRNA 能夠高效轉染多種類型細胞，包括原代細胞、多種腫瘤細胞系、成纖維細胞系等，具有廣闊的應用平臺，有望在多種類型細胞的基礎研究及臨床治療中發揮價值。此外，modRNA 不僅能夠實現多種蛋白在同一細胞內的表達，還能夠翻譯表達產生有功能的核內轉錄因子，為多基因替代性治療、重編程、轉分化等研究提供一定的前期基礎。

綜上所述，MessageMax 作為一種理想的modRNA轉染的陽離子脂質體，能夠高效、快速地將modRNA導入目的細胞中產生所需的蛋白，進而實現其治療價值，也使得modRNA 成為一種高效而安全的基因載體，在基礎研究和臨床轉化中均具有廣闊的前景。