魚膠原構(gòu)建組織工程軟骨的可行性研究

趙少華 王一公 徐勇 段亮

由于體內(nèi)軟骨再生能力有限，創(chuàng)傷、腫瘤等引起的各種軟骨缺損治療（如耳、氣管、關(guān)節(jié)軟骨等）在臨床上仍是一大挑戰(zhàn)，組織工程技術(shù)的發(fā)展為軟骨缺損修復(fù)帶來(lái)了希望。支架材料作為組織工程的重要組成部分，應(yīng)具有細(xì)胞毒性小、生物相容性好、來(lái)源廣泛等特點(diǎn)。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)源支架的基質(zhì)成分和比例與天然軟骨更為接近，但人源性軟骨細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)源有限，且其致密的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致脫細(xì)胞和種細(xì)胞難度較大，因此限制了其研究與發(fā)展。

膠原是生物機(jī)體中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一。天然膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，為細(xì)胞的附著、遷移和增殖提供了必需的生物環(huán)境。同時(shí)，膠原蛋白又具有低抗原性和創(chuàng)傷修復(fù)的優(yōu)點(diǎn)，有利于機(jī)體的恢復(fù)。膠原蛋白還具有良好的生物相容性和組織親和性，幾乎不會(huì)引起機(jī)體的炎癥或排斥反應(yīng)。近年來(lái)，天然膠原在生物醫(yī)學(xué)材料和組織工程材料領(lǐng)域中的應(yīng)用日趨廣泛，如膠原海綿在燒（燙）傷創(chuàng)面覆蓋、手術(shù)空腔填充和快速止血中的應(yīng)用；重組膠原纖維材料在人造跟腱/肌腱中的應(yīng)用；膠原凝膠在面部皮膚美容中的應(yīng)用等[1-4]。但是，由于受人畜共患疾病的影響，傳統(tǒng)的牛、羊來(lái)源的天然膠原的生物安全性受到質(zhì)疑，提取相對(duì)容易、生物安全性更好的魚源膠原正受到關(guān)注，圍繞魚源膠原蛋白的提取、性能分析等研究已得到廣泛開展，為魚源膠原在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的應(yīng)用提供了良好基礎(chǔ)[5-7]。

本研究采用凍干法制備多孔海綿狀魚膠原支架材料，并且復(fù)合軟骨細(xì)胞于體外培養(yǎng)2 周、4 周，以觀察魚膠原支架的細(xì)胞相容性及體外軟骨構(gòu)建情況。隨后將該軟骨細(xì)胞-魚膠原復(fù)合物植入裸鼠皮下培養(yǎng)6 周，以探索魚膠原支架構(gòu)建組織工程軟骨的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

胰蛋白酶、低糖DMEM 培養(yǎng)基、高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、磷酸鹽緩沖液（Hyclone 公司，美國(guó)），DNA 含量檢測(cè)試劑盒（天根生化科技有限公司），GAG 阿爾新藍(lán)法檢測(cè)試劑盒（生工生物工程股份有限公司）；總膠原蛋白檢測(cè)試劑盒（北京博蕾德生物科技有限公司）。生物力學(xué)分析儀（Instron 公司，美國(guó)）。

1.2 魚膠原蛋白的制備

將海鱸魚加工副產(chǎn)物（魚頭、魚皮和魚骨）洗凈，絞肉機(jī)絞碎后混勻，以其質(zhì)量20 倍的0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液浸泡24 h，以去除雜蛋白；用蒸餾水洗至中性，再用其質(zhì)量20 倍的0.6 mol/L 的鹽酸浸泡24 h 脫鈣；用蒸餾水洗至中性，最后用其質(zhì)量2倍的10%的乙醚浸泡24 h，反復(fù)2 次，共脫脂48 h；脫脂后，蒸餾水反復(fù)洗滌，瀝干，用等量的0.5 mol/L的乙酸溶液浸泡3 d；4 400 r/min 離心20 min 后取上清，凍干即可得到膠原蛋白粗品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 魚膠原多孔支架材料的制備

將上述制備好的魚膠原蛋白溶于0.5 M 醋酸中，制備成50 mg/mL 的膠原溶液，注入模具中，厚度為400 μm，凍干成多孔膠原海綿。膠原海綿用EDC/NHS 于4 ℃交聯(lián)12 h，0.1 M Na2HPO4充分清洗，以除去殘留交聯(lián)劑。

1.4 魚膠原支架的表面超微結(jié)構(gòu)觀察

將魚膠原材料用2.5%戊二醛4 ℃固定24 h，PBS 緩沖液沖洗后，1%鋨酸4 ℃條件下固定4 h，再用梯度乙醇脫水，CO2干燥器干燥、噴金、粘托，電鏡觀察魚膠原材料的微觀結(jié)構(gòu)。

1.5 魚膠原支架的組織學(xué)觀察

魚膠原支架4%多聚甲醛固定，OCT 包埋，冰凍切片機(jī)切成7～10 μm 的切片，貼在明膠包被的載玻片上，37 ℃烘干12 h。全自動(dòng)染色機(jī)HE 染色后，光鏡觀察并拍照。

1.6 原代軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及擴(kuò)增

無(wú)菌條件下取2 月齡新西蘭兔的耳軟骨，用眼科剪將軟骨塊剪至極小塊之后加入Ⅱ型膠原酶，吸管充分吹打混勻后，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中消化8 h；加入8 mL 的H-DMEM 培養(yǎng)液（含10% FBS，下同）終止消化，充分吹打混勻后收集至15 mL 的離心管中，1 800 r/min 離心5 min，棄上清，加入7 mL 培養(yǎng)液，充分吹打混勻，取混懸液分至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h 后首次換液，此后隔日換液。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到70%～80%后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代。取第2代細(xì)胞備用。

1.7 活死細(xì)胞染色

將經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒的魚膠原支架放入24 孔板中，加入6 μL 濃度1.0×106cells/mL 的軟骨細(xì)胞懸液，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，4 h 后小心加入含10%FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)液至覆蓋復(fù)合物后繼續(xù)培養(yǎng)。分別于第1、4、7 天，進(jìn)行活死細(xì)胞染色。相同的軟骨細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿，在同樣的培養(yǎng)環(huán)境中作為對(duì)照組。活死細(xì)胞染色試劑盒使用步驟：先根據(jù)說(shuō)明書配置活死細(xì)胞染色檢測(cè)工作液；吸去樣品中培養(yǎng)基后加入200 μL 的Live/Dead 檢測(cè)工作液，室溫避光孵育15 min；吸去染液后用無(wú)菌PBS清洗3 遍，加入1 mL 的PBS 溶液，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 細(xì)胞增殖率檢測(cè)

將上述復(fù)合物分別于第1、4、7 天，向每孔中加入10 μL 的CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育。4 h 后將24 孔板里的溶液輕輕吸除，移到96 孔板中，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度。

1.9 軟骨細(xì)胞-魚膠原復(fù)合物體外軟骨構(gòu)建

將軟骨細(xì)胞制備成100×106cells/mL 的細(xì)胞混懸液，均勻接種于魚膠原支架上，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度下放置4 h 后緩緩加入含10%FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)液至覆蓋復(fù)合物后繼續(xù)培養(yǎng)。分別于2周和4 周后進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)檢測(cè)。

1.10 軟骨細(xì)胞-魚膠原復(fù)合物體內(nèi)軟骨構(gòu)建

將上述體外培養(yǎng)1 周后的軟骨細(xì)胞-魚膠原復(fù)合物植入5 只裸鼠背部腔隙中，縫合后分籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。于術(shù)后6 周取材行大體觀察和組織學(xué)檢測(cè)。

1.11 組織學(xué)檢測(cè)

體外培養(yǎng)2 周、4 周和體內(nèi)培養(yǎng)6 周后的標(biāo)本，大體觀察后將標(biāo)本以4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），HE 及Safranin-O 染色，觀察組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原的表達(dá)情況[8]。

1.12 生物力學(xué)與生物化學(xué)檢測(cè)

1.12.1 生物力學(xué)檢測(cè)

取體內(nèi)構(gòu)建的樣本修剪成直徑0.8 cm 的圓形小塊置于生物力學(xué)測(cè)試儀上，以1 mm/min 的速度垂直壓縮，直到樣本組織變形，記錄楊氏模量。

1.12.2 生物化學(xué)檢測(cè)

將樣品置于木瓜蛋白酶溶液中65 ℃消化12 h。根據(jù)試劑盒方法，用阿爾新藍(lán)法檢測(cè)GAG 含量[9]。在乙醇提取和吸附柱吸附后，于洗脫緩沖液中回收基因組DNA。用核酸蛋白質(zhì)定量檢測(cè)器（Nanodrop2000）檢測(cè)DNA 含量。用羥脯氨酸測(cè)定法檢測(cè)總膠原含量。通過(guò)堿水解制備樣品，按上述方法測(cè)定游離羥脯氨酸水解產(chǎn)物[10]。所有樣品重復(fù)3 次。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以GraphPad Prism（Version 5.00，GraphPad Software，美國(guó)）行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用非配對(duì)t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 魚膠原支架的大體、掃描電鏡及組織學(xué)觀察

魚膠原凍干后呈白色多孔狀結(jié)構(gòu)，掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)進(jìn)一步證明膠原纖維交替排列形成較為均勻的多孔狀結(jié)構(gòu)，孔隙直徑在100～200 μm。HE 染色顯示，經(jīng)EDC/NHS 交聯(lián)后的膠原蛋白纖維交錯(cuò)成網(wǎng)，膠原支架呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。膠原支架內(nèi)部孔隙較多且孔隙較為均勻（圖1）。

圖1 魚膠原支架大體、掃描電鏡及組織學(xué)觀察Fig.1 Gross morphology,SEM and histological observation of fish collagen

2.2 活死細(xì)胞染色與細(xì)胞增殖率檢測(cè)

活死細(xì)胞染色結(jié)果顯示，接種軟骨細(xì)胞后1～7 d，軟骨細(xì)胞在魚膠原支架中能很好地增殖。CCK-8 檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了以上結(jié)論，并且和對(duì)照組（純培養(yǎng)液）無(wú)顯著差別，進(jìn)一步說(shuō)明魚膠原具有良好的細(xì)胞相容性（圖2）。

圖2 活死細(xì)胞染色與細(xì)胞增殖率檢測(cè)Fig.2 Living&dead cell staining and cell proliferation assay

2.3 軟骨細(xì)胞-魚膠原支架復(fù)合物體外培養(yǎng)

圖3 體外培養(yǎng)2 周、4 周的軟骨構(gòu)建情況Fig.3 Cartilage regeneration in vitro for 2 and 4 weeks

如圖3 所示，軟骨細(xì)胞-魚膠原復(fù)合物體外培養(yǎng)2 周、4 周，支架表面形成明顯的軟骨組織特征。相比于2 周，4 周時(shí)復(fù)合物大體觀變得更白，表明軟骨變得更加成熟。組織學(xué)觀察顯示，體外培養(yǎng)2 周，已有較多的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)形成，Ⅱ型膠原免疫組化進(jìn)一步證明了所構(gòu)建的組織為均勻的軟骨組織；體外培養(yǎng)4 周，軟骨基質(zhì)進(jìn)一步成熟，特征性軟骨陷窩已初步形成，體外再生軟骨質(zhì)量進(jìn)一步提高。4 周時(shí)，魚膠原支架材料尚未降解完全。

2.4 軟骨細(xì)胞-魚膠原支架復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)

裸鼠皮下培養(yǎng)6 周后，軟骨細(xì)胞-魚膠原復(fù)合物形成瓷白色軟骨樣結(jié)構(gòu)，微孔結(jié)構(gòu)基本上被新生軟骨組織填充，魚膠原支架材料基本降解，且構(gòu)建的軟骨樣組織具有較好的彈性和韌性。組織學(xué)顯示，大量軟骨細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨陷窩形成，Ⅱ型膠原免疫組化證實(shí)新生組織為均勻的軟骨組織（圖4）。

圖4 體內(nèi)培養(yǎng)6 周的新生軟骨大體及組織學(xué)觀察Fig.4 Gross view and histological observation of neocartilage after 6 weeks' culture in vivo

新生軟骨力學(xué)強(qiáng)度近似天然軟骨。其DNA 含量、GAG 含量和總膠原含量等亦均接近天然軟骨（P＜0.05）（圖5）。

圖5 新生軟骨生物力學(xué)和生物化學(xué)檢測(cè)（＊：P＜0.05）Fig.5 Biomechanical and biochemistry analyses of neocartilage (*:P＜0.05)

3 討論

軟骨組織工程為臨床治療軟骨缺損提供了新的思路[11-12]。支架材料是組織工程的三要素之一，是種子細(xì)胞代謝活動(dòng)的場(chǎng)所和連接細(xì)胞與組織的橋梁，在軟骨組織工程中具有重要的作用。理想的軟骨組織工程支架需滿足以下要求：①生物相容性好、免疫原性低；②合適的孔徑大小和孔隙率；③一定的力學(xué)強(qiáng)度，可維持細(xì)胞的三維生長(zhǎng)；④降解速率適中，適配軟骨再生的速率；⑤可模擬軟骨微環(huán)境，促進(jìn)體內(nèi)、外構(gòu)建軟骨。

海洋生物是提供新的具有生物活性的膠原蛋白及其水解物的潛在來(lái)源。近年來(lái)，海洋膠原蛋白越來(lái)越受到關(guān)注，廣泛應(yīng)用于功能性食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[13]。在魚類產(chǎn)品生產(chǎn)中自然產(chǎn)生的副產(chǎn)品——魚皮、魚鱗、魚骨等，約占總產(chǎn)量的30%～50%，大部分被廢棄，僅小部分作為原料加工成飼料。我國(guó)水產(chǎn)品加工尤其是淡水產(chǎn)品加工在取得快速發(fā)展的同時(shí)，產(chǎn)生了大量的廢棄物，這些廢棄物一方面造成了環(huán)境的污染，另一方面造成了資源的浪費(fèi)。因此，將魚膠原加工成支架材料，充分利用其剩余價(jià)值，意義重大。水解魚膠原可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞膠原合成和礦化等生物活性[14]，與幾丁糖復(fù)合的納米纖維膜可促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖[15]，證明了魚膠原具有作為組織工程支架材料的潛能。

本研究通過(guò)凍干技術(shù)成功制備出了具有三維多孔結(jié)構(gòu)的海綿狀魚膠原支架，初步具備構(gòu)建組織工程軟骨的可行性。軟骨細(xì)胞-魚膠原支架復(fù)合物體外培養(yǎng)2 周、4 周，活死細(xì)胞染色及細(xì)胞毒性試驗(yàn)均證明魚膠原具有良好的細(xì)胞相容性，且能在體外環(huán)境誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)分泌。將軟骨細(xì)胞-魚膠原支架復(fù)合物植入裸鼠皮下，6 周后形成了瓷白色的典型軟骨樣組織。組織學(xué)顯示該組織具有典型的軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，免疫組織染色證明其為Ⅱ膠原軟骨基質(zhì)成分。同時(shí)，軟骨特異性基質(zhì)定量及生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果均顯示，裸鼠皮下再生軟骨組織接近天然軟骨。這可能得益于：①凍干后形成的微孔結(jié)構(gòu)，既有利于營(yíng)養(yǎng)的滲入、代謝廢物的排出、氧氣的交換，又促進(jìn)了軟骨細(xì)胞在整個(gè)支架內(nèi)的分布，促進(jìn)了相對(duì)均質(zhì)的軟骨再生；②皮下環(huán)境豐富的毛細(xì)血管系統(tǒng)可為植入組織提供物質(zhì)交換的動(dòng)力；③魚膠原中所含的天然膠原成分，為軟骨再生提供了理想的微環(huán)境。

綜上所述，魚膠原制備成多孔海綿狀支架材料后具有良好的細(xì)胞相容性，且能在體外促進(jìn)軟骨基質(zhì)的分泌，也能在體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定再生軟骨。下一步我們將基于該魚膠原支架對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損進(jìn)行修復(fù)，以期實(shí)現(xiàn)其功能性修復(fù)。