三磷酸腺苷對骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的影響及機制研究

雷杰 何承建 賀夢吟

骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）具有多向分化潛能[1-4]。研究表明，BMSCs 誘導(dǎo)分化的軟骨細胞可治療軟骨損傷[5]。而ATP 可誘導(dǎo)BMSCs 向軟骨細胞分化[6-7]。但其作用機制尚未明確。ATP 主要作用于細胞上的嘌呤受體，嘌呤受體又分為P2X 和P2Y 兩大類[8]。激活P2X 受體具有促進骨形成的作用[9]，而激活P2Y受體則具有抑制骨形成的作用[10]。因此，本研究采用ATP 誘導(dǎo)BMSCs 分化為軟骨細胞，檢測軟骨細胞中相關(guān)mRNA 的表達，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM 低糖完全培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），胎牛血清、胰蛋白酶、反轉(zhuǎn)錄酶（美國Thermo Fisher Scientific 公司），反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑（北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司），SYBR Green Real Time 試劑（上海起發(fā)實驗試劑有限公司），ATP（西安通澤生物科技有限責任公司），考馬斯亮藍G（北京索萊寶科技有限公司），堿性磷酸酶試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司）。

MA-680 實時熒光定量PCR 儀、Multiskan GO酶標儀、Applie Biosystems-PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），Invitrogen 凝膠成像系統(tǒng)（美國英杰生命技術(shù)有限公司），島津UV-2600 紫外可見分光光度計（日本島津儀器有限公司）。

1.2 實驗動物

4～5 周齡SD 大鼠6 只，體質(zhì)量80～100 g，雌雄不限（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。

1.3 實驗方法

1.3.1 BMSCs 的分離和培養(yǎng)

大鼠脫頸椎處死后，75%乙醇浸泡10 min，無菌操作臺上分離兩側(cè)股骨，以含10%胎牛血清DMEM低糖完全培養(yǎng)基10 mL 沖洗骨髓腔。反復(fù)吹打混勻骨髓細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×105cells/mL，接種于50 mL 培養(yǎng)瓶中，置于含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種6 h 后首次換液，以后2～3 d 換液一次。培養(yǎng)7～10 d 后，BMSCs 鋪滿培養(yǎng)瓶時倒置顯微鏡觀察，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 堿性磷酸酶檢測

取第3 代BMSCs，胰酶消化，調(diào)整細胞密度為1×105個/孔接種于6 孔板中。設(shè)對照組和3 個不同濃度ATP 組，每組3 個復(fù)孔。培養(yǎng)12 h 細胞貼壁后，ATP 組加入含有不同濃度ATP（150 μmol/L、300 μmol/L 及600 μmol/L）的培養(yǎng)基，對照組則使用不含ATP 的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)3 d 后，棄培養(yǎng)基，采用4 ℃PBS 沖洗2 遍；每孔加入細胞裂解液80 μL，反復(fù)吹打裂解細胞；取96 孔板，分別加入堿性磷酸酶試劑盒溶液100 μL，后加入細胞裂解產(chǎn)物20 μL；室溫下孵育30 min 后測定405 nm 處吸光度值。

為研究P2X7 受體在ATP 促進BMSCs 成軟骨分化中的作用，在BMSCs 懸液加入ATP（300 μmol/L）的同時加入P2X7 受體抑制劑BBG（1 μmol/L），或單純加入BBG（1 μmol/L），培養(yǎng)10 d，對BMSCs 中堿性磷酸酶的表達進行檢測。

1.3.3 RT-PCR 和實時定量PCR 檢測ATP 對BMSCs 成軟骨分化的影響

取第3 代BMSCs，接種于12 孔板中，調(diào)整密度為3×105cells/mL，分為對照組、ATP 組和成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組為陽性對照。待細胞貼壁生長后，分別使用普通培養(yǎng)基（含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基）、ATP 培養(yǎng)基（含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基+ATP 300 μmol/L）及成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（將含有10%小牛血清DMEM 低糖完全培養(yǎng)基中加入0.05 mmol/L 抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油及100 nmol/L 地塞米松即為成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基）。培養(yǎng)3 d 后收集各孔細胞，加入裂解液提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄、PCR、2%瓊脂糖凝膠電泳，采用Invitrogen 凝膠成像系統(tǒng)進行成像分析（表1）。

取第3 代BMSCs 接種于12 孔板中，調(diào)整密度為3×105cells/mL，分為對照組、ATP 組和ATP+BBG組（每組3 個復(fù)孔）。前兩組同上，ATP+BBG 組以含有ATP 和BBG 的培養(yǎng)基（含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基+300 μmol/L ATP +1μmol/L BBG）培養(yǎng)。3 d 后收集各孔細胞，進行實時定量PCR 分析，采用SYBR Green Real Time 試劑反應(yīng)體系，檢測成軟骨相關(guān)基因SOX6、Sox9、COL1A2 等的相對表達量（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 鏡下觀察及RT-PCR 檢測P2X7 受體表達

首次更換培養(yǎng)基后10 d，倒置顯微鏡觀察顯示BMSCs 呈梭形或多邊形；對P2Y2 和P2X7 受體表達檢測顯示,BMSCs 上存在嘌呤受體，P2Y2 和P2X7均有表達，但P2X7 表達更高（圖1）。

圖1 BMSCs 鏡下觀察及P2X7 受體表達Fig.1 Microscopic observation of BMSCs and expression of P2X7 receptor

2.2 ATP 對BMSCs 堿性磷酸酶表達的影響

不同濃度ATP 處理BMSCs 3 d 后，采用堿性磷酸酶試劑盒對BMSCs 堿性磷酸酶表達情況的檢測結(jié)果顯示，ATP 處理后BMSCs 堿性磷酸酶表達顯著升高，其中ATP 濃度為150 μmol/L 和300 μmol/L時堿性磷酸酶表達量最高（P＜0.05），兩種濃度組間對比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。因此，后續(xù)研究均采用300 μmol/L 為ATP 效應(yīng)濃度（圖2）。

圖2 ATP 對BMSCs 堿性磷酸酶表達的影響Fig.2 Effect of ATP on the expression of alkaline phosphatase in BMSCs

2.3 ATP 對BMSCs 成軟骨指標表達的影響

RT-PCR 檢測ATP 處理3 d 后的BMSCs 成軟骨指標，成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組為陽性對照。結(jié)果表明，ATP 可促進多個成軟骨指標表達上升，但與陽性對照相比效果較弱（圖3）。

圖3 ATP 對BMSCs 成軟骨指標表達的影響Fig.3 Effect of ATP on the expression of cartilage indexes of BMSCs

2.4 BBG 抑制ATP 對BMSCs 促分化作用

加入BBG 阻斷P2X7 受體后，ATP 對堿性磷酸酶的促進作用降低，而BBG 對堿性磷酸酶表達亦無促進作用（圖4）。

圖4 BBG 對ATP 促堿性磷酸酶表達的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of BBG on the promoting effect of ATP on alkaline phosphatase expression

Real-time PCR 結(jié)果顯示，ATP 促進BMSCs 中SOX6、SOX9 及COL2A1 的表達，加入P2X7 抑制劑BBG（1 μmol/L）后，ATP 對BMSCs 成軟骨指標表達的促進作用明顯降低（P＜0.05）（圖5）。

圖5 BBG 對ATP 促成軟骨指標表達的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of BBG on the promoting effect of ATP on cartilage-related indexes

3 討論

本研究結(jié)果表明，一定濃度的ATP 對BMSCs堿性磷酸酶的表達具有促進作用，可促進成軟骨相關(guān)指標SOX6、SOX9 及COL2A1 等的表達；同時，ATP 對BMSCs 的促軟骨分化作用與P2X7 受體具有密切相關(guān)性，對P2X7 受體采用BBG 阻斷后，ATP的促進作用明顯降低，表明ATP 對BMSCs 的促軟骨分化作用可能是通過介導(dǎo)P2X7 受體而發(fā)揮作用。

堿性磷酸酶為BMSCs 成軟骨分化的早期指標，其表達水平增加提示BMSCs 向軟骨方向分化[11]。SOX6、SOX9、COL1A2 等都為促進成軟骨分化的重要基因[12-14]。SOX6 為BMSCs 成軟骨分化的重要標志蛋白質(zhì)[15]，其表達水平增加提示ATP 具有促進BMSCs 成軟骨分化的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，在力學(xué)作用的刺激下軟骨細胞釋放大量ATP，ATP 除具有直接功能外，還具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[16-17]。ATP 可與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，其主要受體為P2X 和P2Y 兩類。P2X 受體激活對成軟骨具有明顯的促進作用[9]，而P2Y 受體激活則表現(xiàn)為抑制成軟骨作用[10]。受體激活主要與ATP 濃度相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，阻斷P2X 受體后，ATP 促BMSCs 成軟骨分化作用明顯降低，表明ATP 可能是通過介導(dǎo)P2X7 受體發(fā)揮其促骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨分化作用。Zimmermann 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ATP 具有促進軟骨細胞釋放PGE2，促進軟骨細胞鈣離子內(nèi)流等作用。Potucek 等[19]的研究表明，ATP 可激活小膠質(zhì)細胞絲裂原活化蛋白激酶信號通路。但ATP是否通過激活信號通路促進BMSCs 向軟骨細胞分化尚需深入研究。

綜上所述，一定濃度的ATP 對BMSCs 向軟骨細胞分化具有促進作用，可能是通過介導(dǎo)P2X7 受體而發(fā)揮作用。