基于靜電紡絲人臍帶華通膠構建組織工程軟骨的實驗研究

李豪 徐勇 夏會堂 周廣東 姜格寧 李承德

由于體內軟骨再生能力有限，使得創傷、腫瘤等引起的軟骨缺損成為臨床治療中的難題[1]。近年來，組織工程技術的興起為軟骨缺損的修復帶來了新的希望[2]。組織工程主要包括三大要素：支架材料、種子細胞和生長因子。缺乏理想的支架材料是組織工程發展亟待解決的難點[3]。

天然材料具有生物相容性優良，細胞毒性小，成分接近天然軟骨等優點。軟骨細胞外基質來源的支架基質成分及其比例，與天然軟骨更為接近。但人源性軟骨細胞外基質來源有限，且其結構致密不利于脫細胞處理，嚴重限制了組織工程軟骨的應用與發展[4]。

研究發現，臍帶華通膠富含膠原、透明質酸和糖胺聚糖等成分，且無血管分布、神經支配和淋巴回流。此外，華通膠保護臍帶血管，防止其受外力擠壓，從而保障了正常的臍帶血運。該作用與關節軟骨緩沖受力，減少變形、損傷及摩擦的作用相似。由此可見，華通膠在成分、結構、功能上均與軟骨組織非常類似。此外，臍帶華通膠還具有以下特點：①可支持華通膠間充質干細胞的增殖，故也可能支持其他干細胞增殖；②華通膠中透明質酸廣泛表達CD44 受體，而軟骨細胞也表達CD44，使得軟骨細胞能很好地黏附在華通膠上；③華通膠是多肽生長因子儲存庫，這些生長因子有利于細胞的增殖分化及細胞外基質的重塑；④臍帶是分娩廢棄物，不涉及倫理問題，來源豐富。因此，華通膠被認為是軟骨組織工程支架材料的理想來源[5-7]。

本研究將臍帶華通膠混合聚己內酯（Polycaprolactone，PCL）進行靜電紡絲，以形成具有一定力學強度和孔隙率的納米纖維膜，并將該膜復合軟骨細胞后植入裸鼠皮下，擬在裸鼠體內培養6 周，以期能成功構建較成熟的組織工程軟骨組織。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

胰蛋白酶、高糖DMEM 培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、磷酸鹽緩沖液（Hyclone 公司，美國）；DNA 含量檢測試劑盒（天根生化科技有限公司），總膠原蛋白檢測試劑盒（北京博蕾德生物科技有限公司），透明質酸染色試劑盒（北京雷根生物科技有限公司）。

磁力攪拌器（鞏義予華儀器有限責任公司）；精確微量注射泵（LSP01-1A，保定市蘭格恒流泵有限公司）；靜電紡絲儀器（KDS-100 型，美國Le-Parmer公司）；靜電紡絲高壓電源（天津市東文高壓電源廠）；真空冷凍干燥儀（上海實驗室儀器有限公司）；場發射掃描電子顯微鏡（S-4800 型，日本JEOL 公司）。

1.2 實驗動物

6 周齡新西蘭白兔10 只（上海甲干生物科技有限公司），雌雄不限；5 只BALC/c 裸鼠，雌雄不限。本實驗遵守實驗動物倫理原則。

1.3 制備脫細胞的人臍帶華通膠

在不違反醫學倫理的情況下，收集新鮮健康的人臍帶。無菌條件下，去除臍帶內的動靜脈，剝除臍帶外面的膜，可獲取膠凍樣組織。把獲得的華通膠置于1 N NaOH 溶液中，室溫條件下脫細胞處理4 h，冰醋酸調節pH 值至7.0 備用。

1.4 生物化學檢測

將樣品（脫細胞前后標本）置于木瓜蛋白酶溶液（Sigma-Aldrich）中于65 ℃消化12 h。乙醇提取和吸附柱吸附后，在洗脫緩沖液中回收基因組DNA。用核酸蛋白質定量檢測器（Nanodrop 2000）檢測DNA含量。用羥脯氨酸測定法檢測總膠原含量。通過堿水解制備樣品，根據先前描述的方法測定游離羥脯氨酸水解產物。以上所有樣品的分析重復3 次。

1.5 制備粉末狀人臍帶華通膠

將上述脫細胞后的華通膠加入勻漿機內，然后加入5 倍體積的無菌三蒸水，4 ℃下充分攪拌粉碎，即可制成華通膠勻漿。將勻漿放入-20 ℃冰箱冷凍過夜，再放入真空冷凍干燥箱中干燥48 h 后與胃蛋白酶按1:50 質量比混合，溶于0.5 mol 醋酸溶液（pH 2.8～3.0），放入37 ℃搖床48 h；將溶液放入離心機，4 ℃、3 500 r/min 離心5 min，收集上清液于新的離心管中，緩慢滴加NaOH 溶液調節pH 到7 左右。將溶液-20 ℃冰箱冷凍過夜，再放入真空冷凍干燥箱中干燥48 h，得到華通膠粉末。

1.6 靜電紡絲

秤取等質量的華通膠粉末與PCL 粉劑溶于六氟異丙醇，調節質量體積比為12%，配置華通膠/PCL溶液。將該溶液置于精確微量注射泵中，連接靜電紡絲儀器，接通靜電紡絲高壓電源。調整靜電紡絲參數：電壓15 KV，推進速度0.6 mL/h，接收距離15 cm，室溫25 ℃，環境濕度40%～50%；進行混合靜電紡絲，以鋁箔接收。將上述所得靜電紡絲置入含有25%戊二醛蒸汽的密閉容器皿中熏蒸30 min，以達到充分交聯，最終真空凍干24 h 取出備用。

1.7 大體和微觀形貌表征

將納米纖維電紡膜裁減為直徑1 cm 的圓片，以觀察大體形態。將該納米纖維電紡膜噴金后，掃描電鏡觀察其結構特點及納米纖維排布情況。

1.8 原代軟骨細胞的分離培養及擴增

無菌條件下取2 月齡新西蘭兔的耳軟骨，用眼科剪將軟骨塊剪至極小塊，加入Ⅱ型膠原酶，用吸管充分吹打混勻后，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中消化8 h；加入8 mL 的H-DMEM 培養液（含10% FBS，下同）終止消化，充分吹打混勻后收集至15 mL 的離心管中，以1 800 r/min 離心5 min，棄上清，加7 mL 培養液，充分吹打混勻，取混懸液，分裝至培養瓶中，置培養箱培養。24 h 后進行首次換液，此后隔日換液。顯微鏡下觀察細胞生長情況，當細胞生長面積達到培養瓶底部的70%～80%后，用胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養。取第2 代細胞備用。

天理圖書館收藏17號敦煌寫卷，主要來自李盛鐸、許承堯、張大千等舊藏，其中張大千舊藏構成了天理圖書館藏品的主體。這批文獻的主要內容是漢文佛典，還有藏文、回鶻文等佛教、道教經典，以及論語、詩經、開蒙要訓、社司轉帖、本草等殘卷等。除寫本外，該館還藏有大谷探險隊帶回的敦煌紙本繪畫“玄奘三藏像”，但入藏途徑尚未明。

1.9 納米纖維膜的細胞相容性

將第2 代軟骨細胞制備成1.0×105cells/mL 的細胞混懸液，均勻接種于支架上，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下放置4 h，隨后加入8 mL 的H-DMEM 培養液培養，隔日換液。分別于體外培養的第1、5、9 天進行活死細胞染色和CCK-8 定量檢測，檢測方法參照試劑盒說明書。

1.10 軟骨細胞-纖維膜復合物體內培養

將第2 代軟骨細胞制備成1.0×108cells/mL 的細胞混懸液，均勻接種于支架上。采用“三明治”模型將軟骨細胞-纖維膜疊加4 層，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度下放置4 h。5 只BACL/c 裸鼠麻醉后，將4 層結構的軟骨細胞-纖維膜復合物植入背部腔隙中，縫合傷口。術后分籠飼養，自由活動。于術后6 周取材檢測。

1.11 組織學檢測

大體觀察脫細胞前后的標本和體內培養6 周的標本，然后將標本以4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋、切片（厚度為5 μm）。分別行透明質酸和天狼猩紅染色，觀察華通膠是否富含透明質酸成分和膠原成分；HE 染色及Safranin-O 染色，觀察組織結構及細胞外基質分泌情況。免疫組化檢測Ⅱ型膠原的表達情況，進一步證明構建組織的軟骨表型。

1.12 統計學分析

采用GraphPad Prism 軟件（Version 5.00，Graph-Pad Software，美國），數據以（）表示，組間比較采用非配對t 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人臍帶華通膠成分

臍帶是胎兒和胎盤之間的連系結構，形狀如繩索，表面光滑透明，內含結締組織和1 支臍靜脈、2根臍動脈（圖1a）。Safranin-O 染色顯示華通膠富含GAG 成分（圖1b）；透明質酸染色顯示華通膠富含透明質酸成分（圖1c）；天狼猩紅染色顯示華通膠富含膠原成分（圖1d）。

圖1 人臍帶大體觀察和華通膠組織學觀察Fig.1 Gross observation of human umbilical cord and histological observation of human Wharton's jelly

2.2 人臍帶華通膠基質脫細胞處理

剪碎后的華通膠基質呈白色膠凍樣（圖2a），經脫細胞處理后，華通膠基質大體形狀基本不變，色澤變為淺黃色（圖2b）。DNA 定量檢測顯示，脫細胞后DNA 含量比脫細胞前明顯減少，證實細胞成分基本去除（圖3c）。同時，膠原含量檢測顯示脫細胞后膠原成分略有下降（圖2d）。

圖2 人臍帶華通膠脫細胞前后對比Fig.2 Comparison of Wharton's jelly before and after decellularization

2.3 靜電紡絲

圖3 靜電紡絲Fig.3 Electrospun

2.4 細胞相容性

軟骨細胞接種于纖維膜后，活死細胞染色顯示細胞可以黏附、存活，并且穩定增殖（圖4a）。CCK-8細胞增殖曲線結果顯示細胞可穩定增殖（圖4b）。

圖4 靜電紡絲纖維膜的細胞相容性Fig.4 Biocompatibility of electrospinning membrane with chondrocytes

2.5 體內軟骨再生

裸鼠皮下培養6 周后的組織學顯示，在纖維膜之間有大量軟骨細胞外基質和特異性軟骨陷窩形成，并且纖維膜有一定程度的降解（圖5a、b）。Ⅱ型膠原免疫組化證實新生組織為軟骨組織（圖5c）。

圖5 體內軟骨再生Fig.5 Cartilage regeneration in vivo

3 討論

軟骨損傷在臨床較為常見，但軟骨自我修復能力有限，而目前的一些傳統方法尚無法獲得滿意的治療效果。應用組織工程技術構建組織工程軟骨被認為是目前較有前景的治療手段。但迄今為止，構建的組織工程軟骨仍無法真正地應用于臨床治療。

理想的支架材料是制約軟骨組織工程臨床轉化的核心難點。理想的支架材料應該最大程度模仿軟骨細胞外基質[8-9]。因此，同種異體軟骨脫細胞處理的軟骨細胞外基質被認為是組織工程最佳的成分仿生軟骨組織工程支架材料。但是，由于來源受限，且結構致密不利于脫細胞處理以去除其免疫原性，一定程度影響了其臨床應用。

人臍帶華通膠富含透明質酸、糖胺多糖及膠原等，還包含很多生長因子，諸如胰島素生長因子、堿性成纖維生長因子、轉化生長因子β、血小板生長因子、表皮生長因子和其他細胞外基質蛋白。這些生長因子和細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）蛋白為種子細胞提供結構支撐，促進其黏附、增殖，還能提供保持細胞表型的微環境。人臍帶華通膠成分與天然軟骨ECM 類似，而且人臍帶華通膠來源的間充質干細胞具有向軟骨細胞分化的能力[10]。研究發現，臍帶和軟骨組織有許多相似之處：組織內無毛細血管，營養獲得來源于組織滲透；基質中含有大量GAG、膠原及透明質酸成分，這與本研究結果一致。因此，可以推測人臍帶細胞外基質和人軟骨ECM 一樣，能很好地促進軟骨細胞的增殖和細胞表型的維持。本研究通過NaOH 溶液對臍帶華通膠進行脫細胞處理，結果顯示，在保證去除絕大部分DNA 的情況下，保留了大量的膠原成分，可作為軟骨再生的支架材料[11]。

我們的前期研究表明，華通膠的力學性能較弱（經過脫細胞處理后力學性能變得更弱），且降解速度過快，與軟骨基質生長速度不匹配。PCL 是最常用的合成材料之一，已被FDA 批準在臨床中運用[12-13]。PCL 具有機械性能強、降解慢、生物相容差的特點。因此，PCL 與華通膠混合后可取長補短，最大限度發揮各自的優點。

靜電紡絲納米纖維具有以下特點：①與天然軟骨ECM 相近的微觀構造，使制備的支架能夠仿生天然ECM 的結構特點；②極高的比表面積，為活性因子的有效釋放提供了理想平臺；③簡便快捷、成本低廉、結構可控。因此，靜電紡絲納米纖維被認為是理想的組織工程支架材料。本研究采用華通膠與PCL混合后進行靜電紡絲，制成的混合纖維膜結構上更加接近天然ECM，更有利于種子細胞的黏附、增殖及分化[14-16]。

理想的軟骨組織工程支架材料應該具有良好的細胞相容性，并且能支持軟骨再生。本研究將軟骨細胞接種于華通膠/PCL 靜電紡絲纖維膜，體外活死細胞染色及CCK-8 細胞增殖曲線均證實該纖維膜具有良好的細胞相容性，能夠支持軟骨細胞的黏附、生長及增殖。將軟骨細胞-纖維膜復合物植入裸鼠皮下6 周后，組織學證實可再生出典型的軟骨組織。以上結果均證實華通膠/PCL 靜電紡絲纖維膜適合作為組織工程軟骨再生的支架材料。

綜上所述，本實驗制備的華通膠/PCL 靜電紡絲纖維膜免疫原性低、無細胞毒性作用，有細胞生長需要的糖胺聚糖、膠原和生長因子等成分，能夠很好地促進軟骨細胞的增殖。此外，由于華通膠屬于臍帶的廢棄物，來源廣泛，操作簡便，而且不存在倫理學問題，因此是一種理想的軟骨組織工程支架材料來源。下一步我們將應用該纖維膜對軟骨缺損進行修復，以期探索其功能性修復軟骨缺損的可行性。