miRNA-34a基因敲除DBA1/J小鼠的建立

邱莎麗，劉雪，汪竹濤，王蓉，晁天柱，王晶哲，潘子輝，梁銀明，王薈，劉霞，邵啟祥

(1. 江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院免疫遺傳工程實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類存在于細胞中的內源性短小非編碼RNA，長度18～21 kb[1]。miRNA功能廣泛，參與調控哺乳動物的個體發(fā)育、細胞分化和介導免疫調節(jié)等生命過程中的重要事件[2]。機體的某些疾病，如自身免疫性疾病或腫瘤，與多種miRNA異常表達密切相關[3]。miR-34為種屬保守的miRNA，在脊椎動物中進化為3種同源基因：miR-34a、miR-34b和miR-34c[4]。miR-34a初級轉錄本含有兩個外顯子，之間間隔一個約30 kb的內含子，編碼成熟的miR-34a序列位于第二外顯子；miR-34a不參與編碼任何其他非編碼RNA或蛋白質[5]。在細胞衰老、細胞周期阻滯及凋亡的生物過程中，miR-34a是關鍵的調控因素[6-8]。研究表明，在自身免疫性疾病中miR-34a表達上調，但其作用及機制尚未完全闡明[9]。有研究報道m(xù)iR-34a對B細胞中特異性表達的轉錄因子Foxp1具有顯著的調節(jié)作用，可導致B細胞發(fā)育異常，從而引起彌漫性大B細胞淋巴瘤等惡性淋巴細胞白血病[10]。miR-34a在復發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥患者外周血CD4+T淋巴細胞中表達上調，作用機制是miR-34a抑制Wnt1，通過其下游TCF-RORγt途徑促進樹突狀細胞前體細胞分化為經典樹突狀細胞和漿細胞樣樹突狀細胞，并分泌IL-17a抑制經典樹突狀細胞活化CD4+T細胞[11]。本實驗室近期研究表明，miR-34a能夠負向調控Foxp3表達，導致Treg/Th17細胞比例失衡，加重膠原蛋白誘導的類風濕關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型動物的病情[12]。上述研究表明，在T、B、樹突狀細胞的分化成熟階段過程中，miR-34a起重要作用。由此推測miR-34a異常表達通過多種機制參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。但是，miR-34a與CIA之間的關系尚不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9技術建立miR-34a基因敲除小鼠模型，并繁育，同時對其相應生物學性狀進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級DBA1/J小鼠，10周齡，雄鼠7只，雌鼠30只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，共37只。合格證編號：11400700245592。

質粒：PX260、PX330包含人源化Cas9、crRNA、tracrRNA序列(美國Addgene公司)；MssⅠ(PmeⅠ)酶、T7核酸轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；M2培養(yǎng)基、M16培養(yǎng)基(美國Millipore公司)；鼠尾基因型快速鑒定試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；PCR試劑 (上海翊圣生物科技有限公司)；熒光素標記抗體均購自美國Biolgend公司：抗鼠CD3-FITC、抗鼠CD4-PE、抗鼠CD8a-Percp-Cy5.5、抗鼠CD45-APC、抗鼠CD19-PE；實驗中所采用的引物由上海生工生物工程合成，序列見表1；Trizol、反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(寶生物生物工程有限公司)；異丙醇、氯仿、無水乙醇(上海國藥集團)。

梯度PCR儀、實時熒光定量PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳儀(美國Bio-Rad有限公司)；CytoFLEX流式細胞儀(貝克曼庫爾特商貿有限公司)。

1.2 miR-34a基因敲除DBA1/J小鼠的構建

1.2.1 CRISPR/Cas9靶向位點的設計及Cas9 mRNA和sgRNA的制備 選擇在線設計工具(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)，設計針對miR-34a特異性打靶位點的單鏈引導RNA(single guide RNA，sgRNA)序列。為確保能完全敲除miR-34a的基因組DNA序列，本實驗選擇3個特異性sgRNA序列，其基因組位置見圖1，序列見表1。此3個特異性sgRNA覆蓋miR-34a外顯子，當其同時發(fā)揮作用對基因組DNA進行切割時，可保證將miR-34a外顯子(tgactgcgggcgcctcagcctgggctggCCAGCTGTGAGTAATT-CTTTGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTTGTGAGTATTA-GCTAAGGAAGCAATCAGCAAGTATACTGCCCTAG-AAGTGCTGCACATTGTtgggccgag)完全剔除。用限制性內切酶PmeⅠ消化的線性化質粒pT7-3×Flag-hCas9作Cas9 mRNA體外轉錄的模板，按照T7核酸轉錄試劑盒說明行體外轉錄。

1.2.2 sgRNA和Cas9 mRNA顯微注射入小鼠受精卵 采用顯微操作系統(tǒng)將Cas9 mRNA(50 ng/μL)和sgRNA(50 ng/μL)共注射至DBA1/J小鼠受精卵的胞質中；注射后的受精卵細胞用M2培養(yǎng)基洗滌3次；用覆蓋有胚胎培養(yǎng)用礦物油的50 μL M16培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。當細胞發(fā)育至兩細胞胚胎階段時，將其轉移至10周齡ICR假孕雌鼠(轉種前一晚與輸精管結扎的ICR雄鼠合籠交配)的輸卵管壺腹部(每個輸卵管轉種10～20個胚胎)。F0代小鼠出生6周后，剪尾，提取基因組DNA行PCR擴增鑒定。

1.2.3 miR-34a基因敲除小鼠的飼養(yǎng)、繁殖 小鼠飼養(yǎng)于IVC小鼠飼養(yǎng)籠系統(tǒng)(蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司)內，溫度為26 ℃，濕度控制為30%～60%。設置2個繁殖籠，每個繁殖籠用1只經CRISPR/Cas9技術進行全基因組miR-34a基因敲除的DBA1/J F0小鼠和3只DBA1/J野生型小鼠配對進行繁殖，對其子代F1小鼠基因型行PCR鑒定，將得到的基因型為miR-34a-/+的F1代雌雄小鼠進行合籠繁殖，得到F2代小鼠，并對其miR-34a表達量進行檢測鑒定。

表1 miR-34a實時定量PCR引物和sgRNA序列

圖1 sgRNA針對的miR-34a序列在基因組上的位置

1.2.4 miR-34a基因敲除小鼠鑒定 采用試劑盒提取繁殖小鼠的鼠尾DNA，行PCR擴增：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min；結束反應，4 ℃保存，引物序列見表1。取10 μL產物進行2.5%瓊脂糖電泳鑒定PCR產物。利用Trizol提取小鼠淋巴結和脾臟的淋巴細胞總RNA，用熒光定量PCR對miR-34a的表達水平行定量分析。方法簡述如下：cDNA合成42 ℃ 2 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，結束反應，4 ℃保存。miR-34a采用專用引物反轉錄，U6采用反轉錄試劑盒提供的Oligo dT引物。熒光定量PCR程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個循環(huán)。采用ΔCt法對結果進行分析，引物序列見表1。

1.2.5 miR-34a基因敲除小鼠基因測序鑒定 標記新生F2代小鼠鼠耳，按照試劑盒廠商提供的實驗步驟操作提取基因組DNA，并進行PCR擴增，引物序列見表1，送往上海生工生物進行測序，對比序列對繁殖的小鼠進行鑒別。

1.2.6 流式細胞術分析miR-34a基因敲除鼠體內T、B淋巴細胞比例 將野生型和miR-34a-/-DBA1/J小鼠麻醉處死，取外周血、脾臟、胸腺、淋巴結，置于冰上；制備單個細胞懸液，分別取106個細胞置于1.5 mL離心管中；1 000 r/min離心10 min，棄上清液；用100 μL PBS重懸細胞，分別加入0.25 μL熒光標記抗體，T細胞(CD45、CD3、CD4、CD8)，B細胞(CD45、CD19)，4 ℃避光孵育30 min；用1 mL PBS洗去未結合抗體，1 000 r/min離心洗滌10 min；200 μL PBS重懸細胞懸液，用100目篩網(wǎng)過濾于流式管中，上機行流式細胞術檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用Graphad Prism 5.0軟件進行制圖，采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 構建的F0代小鼠鑒定結果

結果如圖2所示，圖中1～6為6只F0代DBA1/J小鼠鑒定結果，DBA1/J野生型小鼠DNA片段為419 bp，獲得2只；miR-34a-/-DBA1/J小鼠的DNA片段為376 bp或者381 bp，獲得2只；而miR-34a-/+DBA1/J小鼠DNA片段為419 bp和376 bp或者419 bp和280 bp，獲得2只。

M：DNA標準參照物；1：缺失43 bp，靶基因序列為376 bp； 2：缺失38 bp，序列為381 bp； 3：缺失139 bp，序列分別為419 bp和280 bp；4、6：序列無缺失，為419 bp；5：缺失43 bp，分別為419 bp和376 bp；7：空白對照；8：WT對照，為419 bp

圖2 F0代DBA1/JmiR-34a-/-小鼠PCR鑒定

2.2 F1代小鼠鑒定與繁育情況

結果顯示，圖中1～11為繁殖的F1代DBA1/J小鼠11只，對其行基因鑒定，獲得4只miR-34a-/+小鼠，DNA片段為419 bp和280 bp。F1代miR-34a-/+小鼠皮膚及毛發(fā)均為灰色，相對于野生型的DBA1/J小鼠而言，其3～10周體重增加并沒有明顯差異(P>0.05 ，n=4)。見圖3和圖4。

M：DNA標準參照物；1～5、8、11：序列分別為419 bp；6、7、9、10：缺失139bp，序列分別為419 bp和280 bp；12：空白對照

圖3 繁殖的F1代DBA1/J小鼠基因鑒定

圖4 繁殖的F1代DBA1/J小鼠年齡與體重關系曲線

2.3 F2代小鼠鑒定與繁育情況

結果顯示，1～10是繁殖的F2代小鼠10只，對其行基因鑒定，獲得5只miR-34a-/-小鼠，靶基因缺失139 bp，DNA片段為280 bp，和野生型DBA1/J小鼠相比較，miR-34a-/-小鼠皮膚及毛發(fā)均為灰色，同時體重生長速度沒有顯著的差異(P>0.05，n=5)。見圖5和圖6。

M：DNA標準參照物；1～5：缺失139 bp，序列為280 bp；6、8、9：缺失139 bp，序列分別為419 bp和280 bp；7：缺失43 bp，序列分別為419 bp和376 bp；10：序列為419 bp；11：空白對照

圖5 繁殖的F2代DBA1/J小鼠基因鑒定

圖6 繁殖的F2代DBA1/J小鼠年齡與體重關系曲線

2.4 F2代小鼠測序、miR-34a表達與繁育情況

基因測序結果表明，F(xiàn)2代miR-34a-/-小鼠基因組DNA中缺失miR-34a基因序列，缺失片段為139 bp，而在野生型小鼠體內存在miR-34a基因序列，表明敲除小鼠miR-34a基因確實已被敲除。同時發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠皮膚、毛色、繁殖情況和正常小鼠并沒有差異。定量PCR檢測結果顯示，miR-34a-/-小鼠不表達miR-34a，而野生型小鼠表達正常水平的miR-34a(P<0.01)，見圖7。

圖7 F2代DBA1/J miR-34a-/-小鼠表觀遺傳分析

2.5 miR-34a基因敲除鼠T、B淋巴細胞比例

結果顯示，胸腺、脾臟、淋巴結、外周血中CD4+、CD8+T細胞的比例和野生型小鼠比較沒有明顯差別(P>0.05)。在脾臟、淋巴結和外周血中，敲除鼠體內總B細胞總數(shù)比例較野生型明顯增加(P<0.05)。見圖8、圖9。

圖8 DBA1/J miR-34a-/-小鼠中T細胞表型分析

3 討論

CRISPR/Cas9是近年來發(fā)展起來的一種基因敲除技術，它主要利用特異性的sgRNA引導、定位和識別目的基因特異性位點，并將Cas9的核酸酶定位到基因組上的靶點，對目的基因位點進行切割，誘導這些基因位點發(fā)生缺失突變。這種方法能夠對基因組DNA的大片段進行刪除，同時不影響其他內源性基因發(fā)揮相應生物學功能[13-14]。本實驗室利用CRISPR/Cas9技術，成功構建miR-34a-/-DBA1/J小鼠。在繁殖過程中未發(fā)現(xiàn)敲除小鼠和野生型小鼠在外觀、體重、生長速度、繁殖能力等方面有明顯差異，推測基因組中miR-34a敲除后對小鼠的表觀遺傳無明顯影響。通過瓊脂糖凝膠電泳、實時定量PCR和測序檢測發(fā)現(xiàn)，后續(xù)繁殖的純合子小鼠中miR-34a表達缺失，表明基因缺失具有穩(wěn)定遺傳性，該種敲除鼠為本實驗室后續(xù)疾病研究提供了穩(wěn)定的實驗模型。CRISPR/Cas9 敲除技術相對于目前利用Foxj1-Cre技術構建的選擇性條件miR-34a-/-小鼠技術[15]而言，它具有基因組編輯特異性強、打靶效率高、方法操作簡單、實驗周期短、實驗成本低、適用性廣泛等優(yōu)點，可極大地提高構建敲除鼠的效率。

圖9 DBA1/J miR-34a-/-小鼠中B細胞比例表達分析

miR-34a可通過抑制轉錄因子Foxp1干擾B淋巴細胞發(fā)育，引起惡性淋巴細胞白血病[10]。本實驗結果顯示，敲除鼠胸腺、脾臟、淋巴結、外周血中CD4+、CD8+T細胞群體比例沒有顯著變化，而在脾臟、淋巴結和外周血中，總B細胞比例明顯增加，表明miR-34a可能對CD4+、CD8+T細胞的發(fā)育分化沒有顯著影響，但是影響B(tài)細胞的分化成熟。然而miR-34a在B細胞的具體作用機制有待進一步研究證實。

類風濕關節(jié)炎是最常見的自身免疫性疾病，自身免疫是發(fā)病的核心機制，還與瓜氨酸化或氨基甲酰化修飾的自身蛋白質的耐受性相關[11]。目前對類風濕關節(jié)炎的研究主要采用DBA1/J小鼠CIA模型。本實驗室研究表明，miR-34a在類風濕關節(jié)炎患者體內表達升高，抑制Foxp3表達，從而導致Treg/Th17比例失衡，促進CIA小鼠疾病的進展，用miR-34a抑制劑治療時可改善CIA模型動物的癥狀，并延遲癥狀的發(fā)生[12]。綜上所述，本實驗室利用CRISPR/Cas9基因編輯技術成功構建miR-34a敲除的DBA1/J小鼠。