高效液相色譜法同時測定赤芍中沒食子酸、沒食子酸丙酯和柚皮素的含量

張海生，王思琦，佘勝楠，周麗紅，丁俞珍，馮春來

(江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013)

赤芍是毛茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根，具有清熱涼血，活血祛瘀的功效[1]。其活性成分主要為萜類及其苷、鞣質類、揮發油、黃酮及其苷等[2-5]。現代藥理學研究表明，赤芍具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗炎和抗病毒等多種藥理作用[6-10]。研究證實，赤芍中所含有的柚皮素、沒食子酸和沒食子酸丙酯具有抗氧化、抗腫瘤等一系列藥理活性[11-26]。雖然目前已有不同藥材中柚皮素、沒食子酸和沒食子酸丙酯的含量測定方法，但尚未建立同時檢測藥材中這三種活性成分的方法。因此，建立一種同時檢測赤芍中沒食子酸、沒食子酸丙酯和柚皮素含量的檢測方法對于赤芍藥效物質研究以及藥材質量控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；InertSustainTMODS-C18色譜柱(上海島津實驗器材有限公司)；XT120A型電子天平(瑞士Precisa公司)。對照品購買自國藥集團，沒食子酸質量分數≥99%，沒食子酸丙酯和柚皮素質量分數≥98%，甲醇和乙酸購買自國藥集團(色譜純)；赤芍藥材(安徽亳州，經江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為毛茛科植物芍藥的干燥根)；超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取20 mg對照品沒食子酸、沒食子酸丙酯和柚皮素，并分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到質量濃度為2 mg/mL的三個活性成分對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取10 g赤芍粉末，置于250 mL圓底燒瓶，按照料液比1 ∶10加入100 mL超純水，40 ℃超聲提取1 h，提取液經3 700 r/min離心20 min，取上清液備用[27-29]。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為C18色譜柱，流動相為甲醇-0.1%乙酸水溶液，體積流量1.0 mL/min，梯度洗脫(0～10 min為90%乙酸水溶液-10%甲醇等度洗脫；10～30 min，由90%乙酸水溶液向50%乙酸水溶液梯度洗脫；30～60 min，50%乙酸水溶液-50%甲醇等度洗脫)，檢測波長270 nm，柱溫30 ℃，進樣量為20 μL。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的確定

分別量取三個活性成分的對照品溶液4 mL于玻璃比色皿中，在200～400 nm波長范圍內進行紫外全波長掃描，如圖1，三個活性成分在240～280 nm內均有良好吸收，沒食子酸，沒食子酸丙酯和柚皮素的最大吸收波長為270 nm，因此確定檢測波長為270 nm。

圖1 三個活性成分紫外全波長掃描圖

2.2 色譜條件考察

按照“1.2.3”項下的色譜條件進樣，得到沒食子酸、沒食子酸丙酯和柚皮素的保留時間分別為8.6、41.7和54.0 min(圖2)，樣品與對照品在相同保留時間有同樣的峰，且三個樣品分離度良好。

A：樣品；B：混合對照品

2.3 線性關系考察

精密吸取“1.2.1”項下三個活性成分的對照品溶液，配制三個成分濃度均為5、20、50、100、150、200和250μg/mL的混合甲醇溶液，按照“1.2.3”項下色譜條件進樣測定，得到不同成分不同濃度的峰面積，計算得到三個活性成分的標準曲線。由圖3可以看出三個活性成分在5～250 μg/mL的濃度范圍內濃度與峰面積成線性正相關，且R2均>0.999。說明方法準確可靠，線性關系良好。

圖3 沒食子酸、沒食子酸丙酯及柚皮素的含量測定標準曲線

2.4 精密度試驗

取“1.2.1”項下對照品溶液，分別取低(5 μg/mL)、中(100 μg/mL)、高(250 μg/mL)三個濃度進行精密度試驗。在“1.2.3”項下色譜條件下，每個活性成分每個濃度每天測量5次，計算日內精密度(表1)。同時每天測量1次，連續測量5 d，計算日間精密度(表2)。結果表明，混合三個活性成分的日內精密度和日間精密度的RSD均<2%，說明精密度良好，方法準確可靠。

表1 三個成分混合物的日內精密度結果

表2 三個成分混合物的日間精密度結果

2.5 加樣回收試驗

精密配制含有三個活性成分100 μg/mL混合儲備液備用。分別加入相當于原藥物量的80%，100%，120%的對照品溶液，計算三個活性成分的回收率。在“1.2.3”項下色譜條件下進樣，計算得到的實驗結果見表3，三個活性成分的回收率均在99%～102%之間，且三個活性成分回收率的RSD均<2%，說明回收率較好，方法準確可靠。

表3 三個成分混合物的回收率結果

2.6 樣品測定

在“1.2.3”項下色譜條件下，取供試品溶液20 μL進行高效液相色譜測定，根據標準曲線計算三個活性成分的含量，重復測量3次。通過計算得到三個成分的含量，其中沒食子酸的含量最高，沒食子酸丙酯次之，柚皮素含量最低。由表4可看出每1 g赤芍生藥中沒食子酸，沒食子酸丙酯，柚皮素平均含量分別為1.867，0.561，0.093 mg，且含量的RSD分別為0.62%，1.46%，1.08%。

表4 赤芍中三個活性成分的含量

3 結論

本研究建立了一種同時測定赤芍中沒食子酸，沒食子酸丙酯，柚皮素三個活性成分的高效液相色譜方法，確定檢測波長為270 nm，建立了三個活性成分的標準曲線。該方法簡單高效同時測定三個活性成分，為其他含有沒食子酸，沒食子酸丙酯和柚皮素的中藥的含量測定與檢測提供參考。同時運用該方法對赤芍提取液進行了含量測定，發現赤芍中沒食子酸，沒食子酸丙酯，柚皮素三個活性成分的含量分別為1.867，0.561，0.093 mg/g，且RSD分別為0.62%，1.46%，1.08%，該方法的建立對赤芍藥材質量控制具有重要意義。