肥胖青少年外周血脂蛋白相關磷脂酶A2的表達及意義

錢雷，于建秀，尚守亮，于廣亞

(1. 濱海縣人民醫院檢驗科，2. 濱海縣中醫院檢驗科，江蘇 鹽城 224500)

近年來，包括中國在內的發展中國家和發達國家青少年肥胖的患病率均大幅上升，導致患者生活質量下降、社會經濟負擔加重[1]。青少年肥胖易伴發脂質水平異常，與成年后心血管疾病、2型糖尿病、高血壓、血脂異常和癌癥密切相關[2]。脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)是一種新型心血管炎癥損傷的生物標志物，參與動脈粥樣硬化的病理生理過程。Lp-PLA2可水解低密度脂蛋白(LDL)上的氧化磷脂，生成氧化游離脂肪酸和溶血卵磷脂，引起內皮功能障礙，參與血管炎癥和動脈粥樣硬化斑塊的發展，在成人動脈粥樣硬化患者外周血中其含量顯著升高[3]。但肥胖青少年外周血Lp-PLA2水平的變化研究較少，本研究通過檢測肥胖青少年外周血Lp-PLA2水平，并通過體外實驗觀察脂肪細胞產生Lp-PLA2的功能，探討肥胖對青少年外周血Lp-PLA2水平的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本次橫斷面研究選擇2018年2月至10月在濱?？h人民醫院體檢的肥胖青少年36例，同時選取年齡、性別相匹配的正常體重青少年36例作為對照組，兩組一般資料具有可比性(表1)。納入標準：根據中國學齡兒童青少年超重、肥胖篩查體重指數值分類標準[4]，篩選年齡12～18歲的肥胖青少年。排除標準：伴自身免疫性疾病、感染性疾病、血液病、惡性腫瘤、肝腎功能不全患者；近期有創傷、手術史，使用抗生素、降脂藥物。本研究得到濱?？h人民醫院倫理委員會的批準，所有青少年的父母都簽署了知情同意書。

表1 研究對象臨床資料

1.2 方法

1.2.1 臨床生化指標檢測 采集受試者清晨空腹靜脈血4 mL，經1000×g離心10 min，收集血清。采用貝克曼AU5800全自動生化分析儀及其配套試劑檢測血清總膽固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、載脂蛋白A1和載脂蛋白B。采用熒光素增強免疫化學發光法(南京諾爾曼公司)檢測血清Lp-PLA2濃度。用測距儀和數字秤分別檢測青少年身高和體重，計算BMI，BMI=體重(kg)/身高(m)平方。

1.2.2 脂肪細胞培養 將人前脂肪細胞(上海聯邁生物公司)置于含有10%胎牛血清和青霉素的DMEM培養液中，于37℃、5%CO2中培養48 h，然后用經典的雞尾酒誘導培養基(0.5 mmol/L 1-甲基3-異丁基黃嘌呤，1 μmol/L地塞米松和10 μg/mL胰島素)培養48 h，誘導細胞分化為脂肪細胞。將培養基更換為含10% 胎牛血清的DMEM培養液，分為LDL-C(67 pmol/L)刺激組、LDL-C+Lp-PLA2抑制劑達普拉締(Darapladib，20 μmol/L, 美國Cayman公司)組，培養48 h，收集細胞和上清液，分別檢測Lp-PLA2 mRNA和Lp-PLA2、oxLDL濃度；培養72 h收集上清液，檢測oxLDL濃度。每次實驗重復6孔。上清液oxLDL和Lp-PLA2濃度檢測分別采用ELISA方法(美國Elabscience公司)和熒光素增強免疫化學發光法(南京諾爾曼公司)，重復3次取均值，oxLDL檢測下限18.75 pg/mL。

1.2.3 RT-PCR檢測脂肪細胞Lp-PLA2 mRNA表達 收集經LDL-C刺激48 h后脂肪細胞，使用Trizol試劑分離總RNA。用cDNA逆轉錄試劑合成cDNA，并使用SYBR green PCR試劑盒(美國Invitrogen公司)擴增分析樣品。引物由上海生工公司合成，Lp-PLA2引物序列：上游5′-TAATGATCGCCTTGACACCCT-3′和下游5′-TACAGCAGCAACTATAAACCC-3′。GAPDH基因引物序列：上游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′和下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。熱循環條件如下：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，35個循環，60 ℃ 1 min。GAPDH基因為內參，通過2-ΔΔCt相對定量法計算每個樣本Lp-PLA2 mRNA表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩組青少年外周血Lp-PLA2濃度比較

與正常體重組外周血Lp-PLA2濃度[(123.5±27.3)ng/mL]相比，肥胖組外周血Lp-PLA2濃度[(353.4±30.4)ng/mL]顯著升高，差異有統計學意義(t=33.76,P<0.01)。

2.2 肥胖青少年外周血Lp-PLA2濃度與BMI和腰圍的相關性分析

肥胖青少年外周血Lp-PLA2濃度與BMI(r=0.414,P=0.012)，腰圍(r=0.460,P=0.004)呈正相關(P<0.05)。見圖1。

2.3 肥胖青少年外周血Lp-PLA2濃度與血脂單變量回歸模型分析

以肥胖青少年外周血Lp-PLA2濃度為因變量，總膽固醇、LDL-C、HDL-C、三酰甘油、載脂蛋白A1及載脂蛋白B為協變量，采用前進法分析顯示，肥胖青少年血清Lp-PLA2水平與總膽固醇、LDL-C、載脂蛋白A1及載脂蛋白B有關(P<0.05)。見表2。

圖1 肥胖青少年血清Lp-PLA2濃度與BMI、腰圍的相關性

表2 Lp-PLA2與血脂的單變量回歸模型分析

2.4 LDL-C調節脂肪細胞Lp-PLA2表達

LDL-C與脂肪細胞共培養48 h后，培養上清液Lp-PLA2濃度較對照組顯著升高，脂肪細胞Lp-PLA2 mRNA表達也顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 LDL-C調節脂肪細胞Lp-PLA2表達 n=6

2.5 Lp-PLA2抑制劑調節脂肪細胞oxLDL合成

與LDL-C刺激組相比，LDL-C+Lp-PLA2抑制劑組培養上清液oxLDL濃度顯著下降，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 Lp-PLA2抑制劑調節脂肪細胞oxLDL合成 ng/mL，n=6

3 討論

肥胖由世界衛生組織定義為對健康構成風險的異常或過度脂肪堆積，是一種具有潛在破壞性后果的全球性疾病。超重或肥胖的青少年成年后肥胖的風險增加約5倍，與肥胖相關合并癥的風險很高[5]。青少年肥胖的持續存在與成年后動脈粥樣硬化等心血管疾病、糖尿病和死亡風險增加密切相關[6]。與肥胖相關的高血壓、糖尿病、血脂異常和睡眠呼吸暫停綜合征也被證明增加心血管疾病的發病率[7]。肥胖人群易發生動脈粥樣硬化的發病機制是脂質、氧化的LDL顆粒和游離脂肪酸可激活炎癥過程，引起內皮功能障礙、高凝狀態和全身性炎癥，從而促進動脈粥樣硬化斑塊形成。

Lp-PLA2是相對分子質量為50 kDa的鈣依賴性絲氨酸脂肪酶，大約80%的循環Lp-PLA2與LDL顆粒結合，水解LDL上的氧化卵磷脂，促進血管壁中oxLDL的形成，生成氧化游離脂肪酸和溶血卵磷脂，引起血管炎癥和動脈粥樣硬化斑塊的發展[8]。近年來研究表明Lp-PLA2是成人心血管風險的良好生物標志物[9]。Acevedo等[10]研究發現，代謝綜合征患者有慢性低度炎癥，并且有更高的Lp-PLA2活性。通過減肥手術可降低肥胖患者oxLDL和Lp-PLA2濃度，增加抗動脈粥樣硬化的血漿HDL形成[11]。本組病例證實，肥胖青少年外周血Lp-PLA2顯著升高，表明肥胖青少年存在心血管疾病發展的風險。

研究證實兒童肥胖與動脈粥樣硬化的指標-頸動脈內膜中層厚度(CIMT)、動脈硬化和成人期冠狀動脈鈣化密切相關[12]。本組資料中，肥胖青少年Lp-PLA2濃度與BMI呈正相關。但BMI沒有提供脂肪分布的信息，用于測量肥胖程度有一定的局限性。腰圍是腹部肥胖的簡單且可靠的指標，男性超過102 cm、女性超過88 cm的人群心血管風險增加[13]。Taylor等[14]證實男性青少年腰圍升高與心臟代謝疾病風險增加有關，腰圍升高的超重女性易引起血壓升高。本組資料也顯示肥胖青少年Lp-PLA2濃度與腰圍呈正相關，表明身體脂肪分布與Lp-PLA2密切相關。

本次研究還表明，肥胖青少年外周血LDL-C、載脂蛋白B等血脂參數是Lp-PLA2濃度升高的影響因素。研究表明成人Lp-PLA2與載脂蛋白B/載脂蛋白A1比例、LDL-C和C-反應蛋白等心血管風險標志物呈正相關，與HDL-C和載脂蛋白A1呈負相關[15]。Hatoum等[16]研究50～60歲的老年患者，觀察到Lp-PLA2與總膽固醇、LDL-C、載脂蛋白B和BMI呈正相關。Okada等[17]研究表明肥胖兒童外周血Lp-PLA2水平與體重、腰圍/身高比和LDL-C水平呈正相關。Motykova等[18]檢查一組非糖尿病肥胖或超重兒童，證實體重減輕可降低Lp-PLA2水平。上述研究均表明，在各年齡階段，LDL-C、載脂蛋白B是導致Lp-PLA2增加的重要參數。

肥胖人群體內脂肪細胞和脂肪組織過度堆積，脂肪細胞能夠攝入LDL-C，釋放脂肪酸、膽固醇和Lp-PLA2[19]。為了進一步闡明脂肪細胞內LDL-C與Lp-PLA2之間的內在聯系，我們通過體外培養脂肪細胞，結果顯示LDL-C刺激脂肪細胞合成Lp-PLA2。Lp-PLA2抑制劑可抑制脂肪細胞代謝LDL-C，導致oxLDL合成減少。結果說明通過抑制脂肪細胞Lp-PLA2降低oxLDL的產生可能是預防動脈粥樣硬化的靶點。

綜上所述，肥胖青少年BMI、腰圍、總膽固醇、LDL-C、載脂蛋白A1及載脂蛋白B與外周血Lp-PLA2升高有關。通過體外實驗證實，LDL-C可促進脂肪細胞分泌Lp-PLA2，通過抑制Lp-PLA2可顯著降低脂肪細胞產生oxLDL。因此，肥胖青少年應盡早通過飲食和生活方式的干預減輕體重，降低脂質水平，控制Lp-PLA2升高，預防心血病疾病的發生。