關于膽囊結石、膽囊結石合并膽總管結石、膽總管結石抗生素抗性基因的初步研究

楊晨瑞 李君劍 張燕忠

(1 山西醫科大學，太原 030001；2 山西大學，太原 030001；3 山西醫科大學附屬人民醫院，太原 030001)

近年來，由于抗生素的濫用而導致大量耐藥性致病菌的出現引起了人們廣泛關注，抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)作為細菌耐藥性的主要原因常被作為研究對象。目前，公認的ARGs的主要作用機制可以包括以下幾種：①調節細菌細胞壁發生滲透性改變，從而限制抗生素與靶位相結合；②編碼產生外排泵將抗生素主動排除菌體細胞外；③對抗生素進行酶修飾；④編碼產生的蛋白酶直接降解抗生素；⑤使菌體產生代謝旁路，使抗生素對菌體新陳代謝的抑制作用失效；⑥調節修飾抗生素的作用靶位；⑦調節抗生素作用靶位的合成水平，使靶位相對“過剩”；⑧形成生物膜[1-2]。并且，由于ARGs兼具“可復制或傳播”的生物特性和“不易消亡或環境持久”的物理化學特性，ARGs在生物體內可長久而持續地傳播，即使攜帶ARGs的細菌被人體免疫系統殺滅或消亡，但它釋放到環境中的DNA與黏土、礦物質和腐殖質物質相結合時，將逃脫核酸酶的降解，在環境中存留的時間更長[3]，并可能通過直接接觸或污染食物鏈等多種途徑進入人體，增加了人類治愈細菌感染性疾病的風險，嚴重威脅人類健康[4-5]。

膽石病(cholelithiasis)包括膽囊和膽管的結石，是常見病和多發病。隨著人民生活水平的提高，我國膽石病的種類和發病率也出現了很大變化。目前，我國膽囊結石的發病率已達10%[6]，國外文獻報道9.2%～33.0%的膽囊結石患者中存在膽總管結石[7]，腹腔鏡膽囊切除后又并發膽總管結石的總體發生率維持在3%～10%之間[8]。目前，膽囊結石以腹腔鏡膽囊切除為主，膽囊結石合并膽總管結石以(膽囊切除+膽道切開探查+T管引流術)為主，膽總管結石以開腹膽總管取石T管引流術為主，而膽道手術后最嚴重的并發癥之一就是感染[9]。常常引起臨床急癥，是一種潛在的威脅生命的疾病。并且由于手術位置及生理的特殊性，容易產生耐藥菌株，使如何為手術后患者選擇合理有效的抗生素治療成為一個難題。因此，了解人體內ARGs的攜帶狀況，可以對臨床工作中合理選擇抗生素提供幫助。

目前，國內抗生素抗性基因污染的研究相對集中于水產養殖、河流污染、動物糞便等[10]。對于人體內ARGs的研究卻很薄弱。鑒于這一研究較少，本文主要對膽道系統內的ARGs進行了檢測，期望為人體內ARGs的研究和進展提供幫助，同時也為抗生素的合理選用提供一定對策。

1 實驗材料與方法

1.1 樣品采集

收集膽囊結石30例(A組)、膽囊結石合并膽總管結石30例(B組)、膽總管結石30例(C組)，采集時間(2017年10月—2018年6月)。結石標本取出后直接放入無菌袋中，并直接送與實驗室，置于-20℃冰箱中儲存。

入選標準：(1)膽囊結石均為行LC手術、膽囊結石合并膽總管結石及膽總管結石均為開腹手術、術前B超及MRI確診(并且術中證實存在結石)；(2)無嚴重心、腦、腎等其他重要器官原發病；(3)狀態良好，可耐受外科手術；(4)對治療相關藥物無過敏并耐受；(5)臨床資料完整；(6)對本研究表示理解和支持并簽署知情同意書。

排除標準：(1)發性硬化性膽管炎患者；(2)肝硬化患者；(3)胰腺癌、膽管癌患者；(4)膽道良性狹窄患者；(5)肝移植患者；(6)免疫功能低下，存在其他部位感染者；(7)正在接受糖皮質激素治療的患者。

1.2 DNA的提取

樣品的基因組提取使用E.Z.N.A?Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek, USA)，按照生產商的說明操作，用多功能讀版機Infinite 200 PRO(TECAN, Sweden)測定DNA濃度和純度。每個樣提取3份，然后將3份DNA提取物合并在一起于-20℃保存待用。

1.3 實時熒光定量PCR

對對照樣品進行了高通量qPCR，共檢測出175種ARGs，根據其豐度大小及查閱相關文獻[11-12]，共選取了其中17種ARGs，具體包括β-內酰胺類抗生素抗性基因10種(blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaampC、ampC-01、ampC/blaDHA、bla-ACC-1、blaCMY、blaGES和cfxA)，氨基糖苷類抗生素抗性基因5種(aac、aacC、aadD、aadA1和strB)，四環素類抗生素抗性基因1種(tetX)，磺胺類抗生素抗性基因1種(sull)，以及1種整合酶基因(intI1)和1種轉座酶基因(tnpA)進行qPCR檢測，同時對細菌16S rRNA基因進行qPCR檢測，這些ARGs在qPCR檢測中所用引物序列見(表1)。含有這些特定基因的質粒由浙江天科生物技術有限公司生產，作為qPCR標準曲線10倍稀釋的標準品，并以無菌水作為陰性對照。將標準品與待測樣品一起在StepOnePlus?實時熒光定量PCR儀器上進行qPCR。所有樣品3個平行，最終計算平均值。

qPCR反應體系采用10μL體系，包括TB Green Premix ExTaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)5μL，上下游引物各0.4μL，ROX Reference Dye(50×)0.2μL，DNA Sample，1μL，ddH2O，3μL。反應熱循環步驟如下：(1)95℃，30s，1cycle；(2)95℃，5s，40cycles；(3)60℃，30s，40cycles。CT檢測限為40個循環。通過熔解曲線和凝膠電泳驗證引物特異性。

表1 抗生素抗性基因的引物序列Tab.1 primer sequences of antibiotic resistance genes

1.4 數據分析

數據采用Microsoft Excel 2013和SPSS 17.0進行處理和分析，作圖采用Microsoft Excel 2013、SigmaPlot 14.0、R 3.5.1及Gephi等完成。用單因素方差分析(one-way ANOVA)對不同部位ARGs的差異性進行分析。用Pearson線性相關分析確定MGEs和ARGs豐度之間是否具有顯著相關性。

2 結果

2.1 16S rRNA、整合酶基因(intI1)、轉座酶基因(tnpA) 的豐度

在該研究中，對膽囊結石、膽囊結石合并膽總管結石、膽總管結石中的16S rRNA、整合酶、轉座酶進行熒光定量PCR檢測(圖1)。本研究發現膽總管結石中的16S rRNA和整合酶基因(intI1)、轉座酶基因(tnpA)相對豐度均要高于其余兩組，但16S rRNA基因相對豐度與膽囊結石合并膽總管結石相比沒有差異，與膽囊結石之間相比有顯著差異。整合酶基因(intI1)相對豐度與膽囊結石合并膽總管結石、膽囊結石之間相比均有顯著差異。轉座酶基因(tnpA)相對豐度與膽囊結石合并膽總管結石相比有顯著差異，與膽囊結石之間相比沒有差異。膽囊結石合并膽總管結石中16S rRNA和整合酶基因(intI1)的相對豐度要高于膽囊結石，但沒有顯著差異。膽囊結石合并膽總管結石中轉座酶基因(tnpA)的相對豐度要與膽囊結石之間相比較低，但沒有顯著差異。

圖1 膽囊結石、膽囊結石合并膽總管結石、膽總管結石中16S rRNA、整合酶、轉座酶基因相對豐度比較Fig.1 The relative abundance of 16S rRNA, intI1 and tnpA genes in gallbladder stones, common bile duct stones and common bile duct stones was compared

各類ARGs的比例及所測得的ARGs的相對豐度如圖2所示中。膽囊結石中，磺胺類抗生素抗性基因所占的比例最高為48.47%，β-內酰胺類抗生素抗性基因占的比例最低為5.92%，具體測到的ARGs有8種，strB基因檢出率最高，為27.1%。blaTEM、cfxA、aacc、aadD、aadA1、tetX、sull的檢出率分別為13.9%、5.1%、5.1%、7.7%、20.7%、4.6%和15.6%。膽囊結石合并膽總管結石中，磺胺類抗生素抗性基因所占的比例最高為46.85%，β-內酰胺類抗生素抗性基因占的比例最低為12.94%，具體測到的ARGs有15種，sull基因檢出率最高，為17.1%。blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、ampC-01、ampC/blaDHA、bla-ACC-1、blaGES、cfxA、aac、aacc、aadA1、strB和tetX的檢出率分別為3.2%、9.4%、4.4%、3.4%、8.9%、4.2%、2.8%、2.5%、8.2%、3.9%、8.1%、6.2%、8.2%和9.4%。膽總管結石中，磺胺類抗生素抗性基因所占的比例最高為32.43%，氨基糖苷類抗生素抗性基因占的比例最低為17.34%，具體測到的ARGs有16種，blaTEM基因檢出率最高，為9.1%。blaCTX-M、blaSHV、ampC-01、ampC/blaDHA、blaACC-1、blaCMY、blaGES、cfxA、aac、aacc、aadA1、strB、tetX和sull的檢出率分別為7.3%、6.5%、7.6%、5.4%、5.6%、3.3%、6.4%、4.0%、4.5%、4.7%、6.9%、6.1%、6.0%、7.8%和8.9%。blaCMY只在膽總管結石組被測到，aadD只在膽囊結石組中被測到。

在測得的β-內酰胺類抗生素抗性基因中(圖3)。膽總管結石中的blaTEM、blaAmpC、blaCMY和blaGES基因的相對豐度均顯著高于其余兩組；膽總管結石中的ampC-01、ampC/blaDHA基因的相對豐度顯著高于膽囊結石，但與膽囊結石合并膽總管結石無顯著差異；blaCTX-M、blaSHV、bla-ACC-1和cfxA這3組間無顯著差異。盡管在膽囊結石合并膽總管結石中測得的ARGs的相對豐度均要高于膽囊結石(除blaCMY基因未被測到外)，但兩者間無顯著性差異。blaCTX-M、blaSHV、blaAmpC、ampC-01、ampC/blaDHA、bla-ACC-1、blaCMY、blaGES這些基因在膽囊結石中未被測到。

在測得的氨基糖苷類抗生素抗性基因中(圖4)。膽總管結石中的aac、aacC基因的相對豐度顯著高于膽囊結石，但與膽囊結石合并膽總管結石無顯著差異；膽總管結石中strB基因的相對豐度顯著高于膽囊結石合并膽總管結石，但與膽囊結石無顯著差異，aadD、aadA1這3組間無顯著差異。膽囊結石合并膽總管結石和膽囊結石中測得的ARGs的相對豐度兩者間無顯著性差異。aac基因在膽囊結石中未被測到，aadD在膽囊結石合并膽總管結石和膽總管結石中未被測到。

在測得的四環素類和磺胺類類抗生素抗性基因中(圖5)。膽總管結石中tetX基因的相對豐度要顯著高于膽囊結石，但與膽囊結石合并膽總管結石無顯著差異。膽囊結石合并膽總管結石中的tetX基因與膽囊結石無顯著差異。sull基因這3組間無顯著差異。

2.2 抗生素抗性基因(ARGs)與可移動遺傳因子(MGEs)的相關性分析

圖2 ARGs的相對豐度及之間的比例Fig.2 Relative abundance and ratio of ARGs

抗生素抗性基因(ARGs)和可移動遺傳因子(MGEs)之間的相關關系如表2所示。在檢測的4類ARGs中，tnpA、intI基因與β-內酰胺類基因、四環素類基因和磺胺類基因均具有顯著正相關(P＜0.01)。β-內酰胺類基因與氨基糖苷類基因、四環素類基因和磺胺類基因都具有顯著相關性(P＜0.01)。氨基糖苷類基因與磺胺類基因、四環素類基因具有顯著相關性(P＜0.01)。四環素類基因和磺胺類基因具有顯著相關性(P＜0.01)。

3 討論

健康人群膽汁內一般無細菌生長，但由于結石、畸形、梗阻、既往手術史等因素致膽道發生病理性改變, 膽道固有的防御、清除機制受到破壞, 細菌異位進入膽道繁殖[13]。有研究發現，膽石癥住院患者約有6%～9%會發生膽道感染[14]。抗生素作為治療感染性疾病的特效藥被廣泛應用于臨床工作中，目前臨床治療感染性疾病時主要依據經驗性用藥，這極易造成抗生素的濫用，進一步導致耐藥菌株的產生，一旦發生重癥感染可造成患者全身炎性反應綜合征、膿毒癥、多臟器功能不全甚至死亡，病死率可高達11%～27%[15]。因此，分析膽石病患者體內ARGs的攜帶情況，為臨床中的藥物使用如如何有效預防并控制細菌的感染、如何合理正確的使用藥物提拱了重要的科學依據。

在本次研究中，檢測到膽石病患者含有豐富的ARGs。其中膽囊結石患者ARGs有8種，膽囊結石合并膽總管結石患者ARGs有15種，膽總管結石患者ARGs有16種。檢測到β-內酰胺類抗生素抗性基因在膽囊結石患者和膽囊結石合并膽總管結石患者中占的比例最低，氨基糖苷類抗生素抗性基因在膽總管結石患者占的比例最低。因此，這些發現可以為膽囊結石患者和膽囊結石合并膽總管結石患者首選β-內酰胺類抗生素及膽總管結石患者首選氨基糖苷類抗生素提供理論上的依據。同時，該研究中還發現，在選擇的β-內酰胺類抗生素抗性基因中，膽總管結石患者中β-內酰胺類抗生素抗性基因的豐度與種類高于膽囊結石患者和膽囊結石合并膽總管結石患者。對氨基糖苷類抗生素抗性基因檢測后發現，除aadD基因在膽總管結石患者為被檢測到外，其他氨基糖苷類抗生素抗性基因的相對豐度均要高于膽囊結石患者和膽囊結石合并膽總管結石患者。本次實驗也對四環素類和磺胺類抗生素抗性基因進行了檢測，發現磺胺類抗生素抗性基因所占比例最高，四環素類次之，這可能與四環素類和磺胺類抗生素曾廣泛應用于臨床有關。因此，應避免使用這兩類抗生素，盡管目前這兩類藥物臨床應用已受到很大限制，但本次研究也為臨床抗生素的經驗用藥的選擇提供了理論上的依據。目前研究發現，高溫可以有效的的減少堆肥中ARGs的豐度[16-17]，也有研究報道在堆肥中加入中藥渣發現ARGs的相對豐度較少了[18]。這些發現對如何可以減低人體內的ARGs的豐度，從而提高人對抗生素的敏感性提供了思路，這也將是我們今后研究的一個主要方向。

圖3 膽囊結石、膽囊結石合并膽總管結石、膽總管結石中β-內酰胺類抗生素抗性基因相對豐度比較Fig.3 Comparison of relative abundance of antibiotics resistance genes to beta-lactam in gallbladder stones, common bile duct stones with common bile duct stones and common bile duct stones

圖4 膽囊結石、膽囊結石合并膽總管結石、膽總管結石中氨基糖苷類抗生素抗性基因相對豐度比較Fig.4 Comparison of relative abundance of aminoglycoside antibiotic resistance genes in gallbladder stones, common bile duct stones with common bile duct stones and common bile duct stones

圖5 膽囊結石、膽囊結石合并膽總管結石、膽總管結石中四環素類和磺胺類抗生素抗性基因相對豐度比較Fig.5 Comparison of relative abundance of tetracycline and sulfonamide antibiotic resistance genes in gallbladder stones, common bile duct stones with common bile duct stones and common bile duct stones

ARGs的出現和傳播與整合酶基因(intI1)、轉座酶基因(tnpA)密切相關性[19-21]，在我們的研究中也證實了這一發現。Heuer等[22]研究發現ARGs和intI1(P＜0.05)有相關性，說明intI1在ARGs橫向轉移起到非常重要的作用，也進一步證明了intI1是在ARGs傳播中的一個重要途徑[23]。在我們的研究中intI1和ARGs之間也表現出顯著相關性，并且tnpA與ARGs也表現出顯著相關性。但是，Forsberg等[24]也認為ARGs與intI1并沒有相關性。這些研究表明，ARGs與可移動基因元件的存在和轉移機制是非常復雜的，這需要在將來的研究中進一步探索。

綜上，膽石病患者含有豐富的ARGs，膽總管結石攜帶ARGs最多，膽囊結石合并膽總管結石次之，膽囊結石攜帶的ARGs最少，同時也發現，膽囊結石患者和膽囊結石合并膽總管結石患者中β-內酰胺類抗生素抗性基因含量最低；膽總管結石患者中氨基糖苷類抗生素抗性基因含量最低。這些發現可以為膽石病患者在臨床上選擇β-內酰胺類抗生素及氨基糖苷類抗生素提供理論依據。而對于如何可以有效減低人體內的ARGs的豐度，這需要在將來的研究中進一步探索。

表2 抗生素抗性基因和可移動基因元件之間的相關關系Tab.2 The correlations among the abundance of antibiotic resistant genes and mobile gene elements