關(guān)于膽囊結(jié)石、膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石、膽總管結(jié)石抗生素抗性基因的初步研究

楊晨瑞 李君劍 張燕忠

(1 山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001；2 山西大學(xué)，太原 030001；3 山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院，太原 030001)

近年來(lái)，由于抗生素的濫用而導(dǎo)致大量耐藥性致病菌的出現(xiàn)引起了人們廣泛關(guān)注，抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)作為細(xì)菌耐藥性的主要原因常被作為研究對(duì)象。目前，公認(rèn)的ARGs的主要作用機(jī)制可以包括以下幾種：①調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞壁發(fā)生滲透性改變，從而限制抗生素與靶位相結(jié)合；②編碼產(chǎn)生外排泵將抗生素主動(dòng)排除菌體細(xì)胞外；③對(duì)抗生素進(jìn)行酶修飾；④編碼產(chǎn)生的蛋白酶直接降解抗生素；⑤使菌體產(chǎn)生代謝旁路，使抗生素對(duì)菌體新陳代謝的抑制作用失效；⑥調(diào)節(jié)修飾抗生素的作用靶位；⑦調(diào)節(jié)抗生素作用靶位的合成水平，使靶位相對(duì)“過(guò)剩”；⑧形成生物膜[1-2]。并且，由于ARGs兼具“可復(fù)制或傳播”的生物特性和“不易消亡或環(huán)境持久”的物理化學(xué)特性，ARGs在生物體內(nèi)可長(zhǎng)久而持續(xù)地傳播，即使攜帶ARGs的細(xì)菌被人體免疫系統(tǒng)殺滅或消亡，但它釋放到環(huán)境中的DNA與黏土、礦物質(zhì)和腐殖質(zhì)物質(zhì)相結(jié)合時(shí)，將逃脫核酸酶的降解，在環(huán)境中存留的時(shí)間更長(zhǎng)[3]，并可能通過(guò)直接接觸或污染食物鏈等多種途徑進(jìn)入人體，增加了人類治愈細(xì)菌感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅人類健康[4-5]。

膽石病(cholelithiasis)包括膽囊和膽管的結(jié)石，是常見(jiàn)病和多發(fā)病。隨著人民生活水平的提高，我國(guó)膽石病的種類和發(fā)病率也出現(xiàn)了很大變化。目前，我國(guó)膽囊結(jié)石的發(fā)病率已達(dá)10%[6]，國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道9.2%～33.0%的膽囊結(jié)石患者中存在膽總管結(jié)石[7]，腹腔鏡膽囊切除后又并發(fā)膽總管結(jié)石的總體發(fā)生率維持在3%～10%之間[8]。目前，膽囊結(jié)石以腹腔鏡膽囊切除為主，膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石以(膽囊切除+膽道切開(kāi)探查+T管引流術(shù))為主，膽總管結(jié)石以開(kāi)腹膽總管取石T管引流術(shù)為主，而膽道手術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一就是感染[9]。常常引起臨床急癥，是一種潛在的威脅生命的疾病。并且由于手術(shù)位置及生理的特殊性，容易產(chǎn)生耐藥菌株，使如何為手術(shù)后患者選擇合理有效的抗生素治療成為一個(gè)難題。因此，了解人體內(nèi)ARGs的攜帶狀況，可以對(duì)臨床工作中合理選擇抗生素提供幫助。

目前，國(guó)內(nèi)抗生素抗性基因污染的研究相對(duì)集中于水產(chǎn)養(yǎng)殖、河流污染、動(dòng)物糞便等[10]。對(duì)于人體內(nèi)ARGs的研究卻很薄弱。鑒于這一研究較少，本文主要對(duì)膽道系統(tǒng)內(nèi)的ARGs進(jìn)行了檢測(cè)，期望為人體內(nèi)ARGs的研究和進(jìn)展提供幫助，同時(shí)也為抗生素的合理選用提供一定對(duì)策。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品采集

收集膽囊結(jié)石30例(A組)、膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石30例(B組)、膽總管結(jié)石30例(C組)，采集時(shí)間(2017年10月—2018年6月)。結(jié)石標(biāo)本取出后直接放入無(wú)菌袋中，并直接送與實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃冰箱中儲(chǔ)存。

入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)膽囊結(jié)石均為行LC手術(shù)、膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石及膽總管結(jié)石均為開(kāi)腹手術(shù)、術(shù)前B超及MRI確診(并且術(shù)中證實(shí)存在結(jié)石)；(2)無(wú)嚴(yán)重心、腦、腎等其他重要器官原發(fā)病；(3)狀態(tài)良好，可耐受外科手術(shù)；(4)對(duì)治療相關(guān)藥物無(wú)過(guò)敏并耐受；(5)臨床資料完整；(6)對(duì)本研究表示理解和支持并簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)性硬化性膽管炎患者；(2)肝硬化患者；(3)胰腺癌、膽管癌患者；(4)膽道良性狹窄患者；(5)肝移植患者；(6)免疫功能低下，存在其他部位感染者；(7)正在接受糖皮質(zhì)激素治療的患者。

1.2 DNA的提取

樣品的基因組提取使用E.Z.N.A?Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek, USA)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明操作，用多功能讀版機(jī)Infinite 200 PRO(TECAN, Sweden)測(cè)定DNA濃度和純度。每個(gè)樣提取3份，然后將3份DNA提取物合并在一起于-20℃保存待用。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

對(duì)對(duì)照樣品進(jìn)行了高通量qPCR，共檢測(cè)出175種ARGs，根據(jù)其豐度大小及查閱相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]，共選取了其中17種ARGs，具體包括β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因10種(blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaampC、ampC-01、ampC/blaDHA、bla-ACC-1、blaCMY、blaGES和cfxA)，氨基糖苷類抗生素抗性基因5種(aac、aacC、aadD、aadA1和strB)，四環(huán)素類抗生素抗性基因1種(tetX)，磺胺類抗生素抗性基因1種(sull)，以及1種整合酶基因(intI1)和1種轉(zhuǎn)座酶基因(tnpA)進(jìn)行qPCR檢測(cè)，同時(shí)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行qPCR檢測(cè)，這些ARGs在qPCR檢測(cè)中所用引物序列見(jiàn)(表1)。含有這些特定基因的質(zhì)粒由浙江天科生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，作為qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，并以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。將標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品一起在StepOnePlus?實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器上進(jìn)行qPCR。所有樣品3個(gè)平行，最終計(jì)算平均值。

qPCR反應(yīng)體系采用10μL體系，包括TB Green Premix ExTaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)5μL，上下游引物各0.4μL，ROX Reference Dye(50×)0.2μL，DNA Sample，1μL，ddH2O，3μL。反應(yīng)熱循環(huán)步驟如下：(1)95℃，30s，1cycle；(2)95℃，5s，40cycles；(3)60℃，30s，40cycles。CT檢測(cè)限為40個(gè)循環(huán)。通過(guò)熔解曲線和凝膠電泳驗(yàn)證引物特異性。

表1 抗生素抗性基因的引物序列Tab.1 primer sequences of antibiotic resistance genes

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013和SPSS 17.0進(jìn)行處理和分析，作圖采用Microsoft Excel 2013、SigmaPlot 14.0、R 3.5.1及Gephi等完成。用單因素方差分析(one-way ANOVA)對(duì)不同部位ARGs的差異性進(jìn)行分析。用Pearson線性相關(guān)分析確定MGEs和ARGs豐度之間是否具有顯著相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA、整合酶基因(intI1)、轉(zhuǎn)座酶基因(tnpA) 的豐度

在該研究中，對(duì)膽囊結(jié)石、膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石、膽總管結(jié)石中的16S rRNA、整合酶、轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)(圖1)。本研究發(fā)現(xiàn)膽總管結(jié)石中的16S rRNA和整合酶基因(intI1)、轉(zhuǎn)座酶基因(tnpA)相對(duì)豐度均要高于其余兩組，但16S rRNA基因相對(duì)豐度與膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石相比沒(méi)有差異，與膽囊結(jié)石之間相比有顯著差異。整合酶基因(intI1)相對(duì)豐度與膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石、膽囊結(jié)石之間相比均有顯著差異。轉(zhuǎn)座酶基因(tnpA)相對(duì)豐度與膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石相比有顯著差異，與膽囊結(jié)石之間相比沒(méi)有差異。膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石中16S rRNA和整合酶基因(intI1)的相對(duì)豐度要高于膽囊結(jié)石，但沒(méi)有顯著差異。膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石中轉(zhuǎn)座酶基因(tnpA)的相對(duì)豐度要與膽囊結(jié)石之間相比較低，但沒(méi)有顯著差異。

圖1 膽囊結(jié)石、膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石、膽總管結(jié)石中16S rRNA、整合酶、轉(zhuǎn)座酶基因相對(duì)豐度比較Fig.1 The relative abundance of 16S rRNA, intI1 and tnpA genes in gallbladder stones, common bile duct stones and common bile duct stones was compared

各類ARGs的比例及所測(cè)得的ARGs的相對(duì)豐度如圖2所示中。膽囊結(jié)石中，磺胺類抗生素抗性基因所占的比例最高為48.47%，β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因占的比例最低為5.92%，具體測(cè)到的ARGs有8種，strB基因檢出率最高，為27.1%。blaTEM、cfxA、aacc、aadD、aadA1、tetX、sull的檢出率分別為13.9%、5.1%、5.1%、7.7%、20.7%、4.6%和15.6%。膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石中，磺胺類抗生素抗性基因所占的比例最高為46.85%，β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因占的比例最低為12.94%，具體測(cè)到的ARGs有15種，sull基因檢出率最高，為17.1%。blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、ampC-01、ampC/blaDHA、bla-ACC-1、blaGES、cfxA、aac、aacc、aadA1、strB和tetX的檢出率分別為3.2%、9.4%、4.4%、3.4%、8.9%、4.2%、2.8%、2.5%、8.2%、3.9%、8.1%、6.2%、8.2%和9.4%。膽總管結(jié)石中，磺胺類抗生素抗性基因所占的比例最高為32.43%，氨基糖苷類抗生素抗性基因占的比例最低為17.34%，具體測(cè)到的ARGs有16種，blaTEM基因檢出率最高，為9.1%。blaCTX-M、blaSHV、ampC-01、ampC/blaDHA、blaACC-1、blaCMY、blaGES、cfxA、aac、aacc、aadA1、strB、tetX和sull的檢出率分別為7.3%、6.5%、7.6%、5.4%、5.6%、3.3%、6.4%、4.0%、4.5%、4.7%、6.9%、6.1%、6.0%、7.8%和8.9%。blaCMY只在膽總管結(jié)石組被測(cè)到，aadD只在膽囊結(jié)石組中被測(cè)到。

在測(cè)得的β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因中(圖3)。膽總管結(jié)石中的blaTEM、blaAmpC、blaCMY和blaGES基因的相對(duì)豐度均顯著高于其余兩組；膽總管結(jié)石中的ampC-01、ampC/blaDHA基因的相對(duì)豐度顯著高于膽囊結(jié)石，但與膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石無(wú)顯著差異；blaCTX-M、blaSHV、bla-ACC-1和cfxA這3組間無(wú)顯著差異。盡管在膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石中測(cè)得的ARGs的相對(duì)豐度均要高于膽囊結(jié)石(除blaCMY基因未被測(cè)到外)，但兩者間無(wú)顯著性差異。blaCTX-M、blaSHV、blaAmpC、ampC-01、ampC/blaDHA、bla-ACC-1、blaCMY、blaGES這些基因在膽囊結(jié)石中未被測(cè)到。

在測(cè)得的氨基糖苷類抗生素抗性基因中(圖4)。膽總管結(jié)石中的aac、aacC基因的相對(duì)豐度顯著高于膽囊結(jié)石，但與膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石無(wú)顯著差異；膽總管結(jié)石中strB基因的相對(duì)豐度顯著高于膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石，但與膽囊結(jié)石無(wú)顯著差異，aadD、aadA1這3組間無(wú)顯著差異。膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石和膽囊結(jié)石中測(cè)得的ARGs的相對(duì)豐度兩者間無(wú)顯著性差異。aac基因在膽囊結(jié)石中未被測(cè)到，aadD在膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石和膽總管結(jié)石中未被測(cè)到。

在測(cè)得的四環(huán)素類和磺胺類類抗生素抗性基因中(圖5)。膽總管結(jié)石中tetX基因的相對(duì)豐度要顯著高于膽囊結(jié)石，但與膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石無(wú)顯著差異。膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石中的tetX基因與膽囊結(jié)石無(wú)顯著差異。sull基因這3組間無(wú)顯著差異。

2.2 抗生素抗性基因(ARGs)與可移動(dòng)遺傳因子(MGEs)的相關(guān)性分析

圖2 ARGs的相對(duì)豐度及之間的比例Fig.2 Relative abundance and ratio of ARGs

抗生素抗性基因(ARGs)和可移動(dòng)遺傳因子(MGEs)之間的相關(guān)關(guān)系如表2所示。在檢測(cè)的4類ARGs中，tnpA、intI基因與β-內(nèi)酰胺類基因、四環(huán)素類基因和磺胺類基因均具有顯著正相關(guān)(P＜0.01)。β-內(nèi)酰胺類基因與氨基糖苷類基因、四環(huán)素類基因和磺胺類基因都具有顯著相關(guān)性(P＜0.01)。氨基糖苷類基因與磺胺類基因、四環(huán)素類基因具有顯著相關(guān)性(P＜0.01)。四環(huán)素類基因和磺胺類基因具有顯著相關(guān)性(P＜0.01)。

3 討論

健康人群膽汁內(nèi)一般無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，但由于結(jié)石、畸形、梗阻、既往手術(shù)史等因素致膽道發(fā)生病理性改變, 膽道固有的防御、清除機(jī)制受到破壞, 細(xì)菌異位進(jìn)入膽道繁殖[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，膽石癥住院患者約有6%～9%會(huì)發(fā)生膽道感染[14]。抗生素作為治療感染性疾病的特效藥被廣泛應(yīng)用于臨床工作中，目前臨床治療感染性疾病時(shí)主要依據(jù)經(jīng)驗(yàn)性用藥，這極易造成抗生素的濫用，進(jìn)一步導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，一旦發(fā)生重癥感染可造成患者全身炎性反應(yīng)綜合征、膿毒癥、多臟器功能不全甚至死亡，病死率可高達(dá)11%～27%[15]。因此，分析膽石病患者體內(nèi)ARGs的攜帶情況，為臨床中的藥物使用如如何有效預(yù)防并控制細(xì)菌的感染、如何合理正確的使用藥物提拱了重要的科學(xué)依據(jù)。

在本次研究中，檢測(cè)到膽石病患者含有豐富的ARGs。其中膽囊結(jié)石患者ARGs有8種，膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石患者ARGs有15種，膽總管結(jié)石患者ARGs有16種。檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因在膽囊結(jié)石患者和膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石患者中占的比例最低，氨基糖苷類抗生素抗性基因在膽總管結(jié)石患者占的比例最低。因此，這些發(fā)現(xiàn)可以為膽囊結(jié)石患者和膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石患者首選β-內(nèi)酰胺類抗生素及膽總管結(jié)石患者首選氨基糖苷類抗生素提供理論上的依據(jù)。同時(shí)，該研究中還發(fā)現(xiàn)，在選擇的β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因中，膽總管結(jié)石患者中β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因的豐度與種類高于膽囊結(jié)石患者和膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石患者。對(duì)氨基糖苷類抗生素抗性基因檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，除aadD基因在膽總管結(jié)石患者為被檢測(cè)到外，其他氨基糖苷類抗生素抗性基因的相對(duì)豐度均要高于膽囊結(jié)石患者和膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石患者。本次實(shí)驗(yàn)也對(duì)四環(huán)素類和磺胺類抗生素抗性基因進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)磺胺類抗生素抗性基因所占比例最高，四環(huán)素類次之，這可能與四環(huán)素類和磺胺類抗生素曾廣泛應(yīng)用于臨床有關(guān)。因此，應(yīng)避免使用這兩類抗生素，盡管目前這兩類藥物臨床應(yīng)用已受到很大限制，但本次研究也為臨床抗生素的經(jīng)驗(yàn)用藥的選擇提供了理論上的依據(jù)。目前研究發(fā)現(xiàn)，高溫可以有效的的減少堆肥中ARGs的豐度[16-17]，也有研究報(bào)道在堆肥中加入中藥渣發(fā)現(xiàn)ARGs的相對(duì)豐度較少了[18]。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)如何可以減低人體內(nèi)的ARGs的豐度，從而提高人對(duì)抗生素的敏感性提供了思路，這也將是我們今后研究的一個(gè)主要方向。

圖3 膽囊結(jié)石、膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石、膽總管結(jié)石中β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因相對(duì)豐度比較Fig.3 Comparison of relative abundance of antibiotics resistance genes to beta-lactam in gallbladder stones, common bile duct stones with common bile duct stones and common bile duct stones

圖4 膽囊結(jié)石、膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石、膽總管結(jié)石中氨基糖苷類抗生素抗性基因相對(duì)豐度比較Fig.4 Comparison of relative abundance of aminoglycoside antibiotic resistance genes in gallbladder stones, common bile duct stones with common bile duct stones and common bile duct stones

圖5 膽囊結(jié)石、膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石、膽總管結(jié)石中四環(huán)素類和磺胺類抗生素抗性基因相對(duì)豐度比較Fig.5 Comparison of relative abundance of tetracycline and sulfonamide antibiotic resistance genes in gallbladder stones, common bile duct stones with common bile duct stones and common bile duct stones

ARGs的出現(xiàn)和傳播與整合酶基因(intI1)、轉(zhuǎn)座酶基因(tnpA)密切相關(guān)性[19-21]，在我們的研究中也證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。Heuer等[22]研究發(fā)現(xiàn)ARGs和intI1(P＜0.05)有相關(guān)性，說(shuō)明intI1在ARGs橫向轉(zhuǎn)移起到非常重要的作用，也進(jìn)一步證明了intI1是在ARGs傳播中的一個(gè)重要途徑[23]。在我們的研究中intI1和ARGs之間也表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，并且tnpA與ARGs也表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。但是，F(xiàn)orsberg等[24]也認(rèn)為ARGs與intI1并沒(méi)有相關(guān)性。這些研究表明，ARGs與可移動(dòng)基因元件的存在和轉(zhuǎn)移機(jī)制是非常復(fù)雜的，這需要在將來(lái)的研究中進(jìn)一步探索。

綜上，膽石病患者含有豐富的ARGs，膽總管結(jié)石攜帶ARGs最多，膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石次之，膽囊結(jié)石攜帶的ARGs最少，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，膽囊結(jié)石患者和膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石患者中β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因含量最低；膽總管結(jié)石患者中氨基糖苷類抗生素抗性基因含量最低。這些發(fā)現(xiàn)可以為膽石病患者在臨床上選擇β-內(nèi)酰胺類抗生素及氨基糖苷類抗生素提供理論依據(jù)。而對(duì)于如何可以有效減低人體內(nèi)的ARGs的豐度，這需要在將來(lái)的研究中進(jìn)一步探索。

表2 抗生素抗性基因和可移動(dòng)基因元件之間的相關(guān)關(guān)系Tab.2 The correlations among the abundance of antibiotic resistant genes and mobile gene elements