高效液相色譜法測定功能性飲料中維生素B1、維生素B2含量

黃偉志，黃桂東，鐘先鋒

（佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東佛山528231）

功能性飲料，是指飲料中添加維生素、氨基酸、膳食纖維等各種功能性成分，從而使其具有保健功效[1]。隨著消費者保健意識增強和運動需求增加，功能性飲料增長迅速。未來五年，功能飲料市場預計復合增長率將超過12%[2]。

維生素B1、維生素B2是部分功能性飲料的主要有效成分。維生素B1，即硫胺素（thiamine），是機體代謝不可缺少的一種水溶性維生素。硫胺素主要貯存在細胞內，參與細胞的三羧酸循環（細胞有氧代謝的核心環節）和磷酸戊糖途徑代謝（能量代謝與細胞的脂質及核酸代謝）[3-4]。運動后，適當補充含維生素B1的功能性飲料可減少丙酮酸、乳酸堆積，減少運動后疲勞的產生，提高耐力運動能力[5-6]。維生素B2，即核黃素（riboflavin），是黃素輔酶的主要成分，直接參與機體復雜的生物氧化過程[7]。一般情況下，人體能夠從飲食中獲取維持正常生理機能所需的核黃素，但在運動過渡情況下會引起機體內核黃素的丟失，而且運動誘導的自由基損傷和氧化損傷涉及全身許多器官和組織，影響機體生長發育和腦功能，進而影響運動能力[8-9]。

雖然部分功能性飲料添加有維生素B1、維生素B2等功效成分，能提高人體運動能力，但是根據我國GB 24154-2015《食品安全國家標準運動營養食品通則》對運動營養食品可添加的營養素中維生素B1、維生素B2規定分別限定在0.2 mg~4 mg、0.2 mg~2 mg（以每日計），因此功能性飲料中不能過量添加維生素B1、維生素B2。目前測定維生素B1、維生素B2的方法主要包括熒光分光光度計法[10]、高效液相色譜法[11-13]和液相色譜-串聯質譜法[14-15]等，而較多實驗室主要依據GB 5009.84-2016《食品安全國家標準食品中維生素B1的測定》、GB 5009.85-2016《食品安全國家標準食品中維生素B2》兩種方法單一測定，較少建立同時測定功能性飲料中維生素B1、維生素B2的方法，單一測定檢測耗時長、效率低，不能滿足多種檢測的需求。

鑒此，本文以功能性飲料中含有的維生素B1、維生素B2為檢測對象，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進行梯度洗脫及優化檢測方法，并對建立的方法進行驗證分析，以期建立可以同時測定維生素B1、維生素B2含量的方法，提高實驗室分析檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

維生素B1、維生素B2（純度≥98%）：中國食品藥品檢定研究院；乙腈：天津市科密歐化學試劑有限公司；三氟乙酸：永華化學科技（江蘇）有限公司；鹽酸：利安隆博華（天津）醫藥化學有限公司；氫氧化鈉：天津市大茂化學試劑廠，以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

1220 高效液相色譜：安捷倫科技有限公司；Milli-Q 超純水系統：Millipore 公司；Vortex-Genie 2 渦旋振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ300E 超聲波清洗器：上海精密儀器儀表有限公司；SHZ-Ⅲ循環水式多用真空泵：上海知信實驗儀器技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液及標準品的配制

1.2.1.1 溶液的配制

根據參考文獻[16-17]的方法，進行配制0.1%三氟乙酸溶液、0.5 mol/L 鹽酸溶液、0.1 mol/L 鹽酸溶液及2 mol/L 氫氧化鈉溶液。

1.2.1.2 標準品的配制

根據參考文獻[17]的方法進行配制維生素B1、維生素B2的標準品。

1）維生素B1標準貯備溶液的制備：準確稱取維生素B1標準品0.080 0 g，加0.1 mol/L 鹽酸溶液溶解，超聲15 min，待全部溶解后，用0.1 mol/L 鹽酸溶液定容至50 mL 棕色容量瓶中。該標準貯備中維生素B1的濃度為1 600 μg/mL。

2）維生素B2標準貯備溶液的制備：準確稱取維生素B2標準品0.040 0 g，加2.5 mL 的2 mol/L 氫氧化鈉溶液溶解，超聲待全部溶解后，加30 mL 水，再加1.2 mL冰乙酸，用水定容至50 mL 棕色容量瓶中。該標準貯備中維生素B2的濃度為800 μg/mL。

3）混合標準工作溶液：分別準確移取維生素B1、維生素B2標準貯備溶液10.00 mL 于同一100 mL 棕色容量瓶中，用0.1%三氟乙酸溶液定容。該溶液中維生素B1、維生素B2濃度分別為160、80 μg/mL。

吸取0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mL 的標準中間液于10 mL 棕色容量瓶中，用0.1 %三氟乙酸溶液定容至10 mL，得到混合標準工作溶液中維生素B1溶度為0、4、8、16、40、80 μg/mL；維生素B2濃度為0、2、4、8、20、40 μg/mL。

標準品及樣品處理：吸取2 mL 標準品液、樣品液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，待進樣。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）流速：1.0mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；波長：280 nm；檢測器：紫外檢測器（UV-detector）；流動相：A 為0.1 mol/L 三氟乙酸溶液，B 為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.3 標準曲線繪制

精密吸取1.2.1.2 中的維生素B1、維生素B2混合標準工作溶液，按照1.2.2 進行測定，以標準物濃度（X）為橫坐標，其對應峰面積值（Y）為縱坐標，建立標準曲線。

1.2.4 檢出限和定量限

將維生素B1、維生素B2混合標準溶液進行梯度稀釋后分別進樣檢測，以信噪比S/N=3 時的進樣溶液濃度為最低檢測濃度，即檢出限（limit of determination，LOD）；以信噪比S/N=10 時的進樣溶液濃度為最低定量濃度，即定量限（limit of quantification，LOQ）。

1.2.5 精密度和回收率

隨機抽取6 份同濃度的混合標準品（維生素B1：16 μg/mL；維生素B2：8 μg/mL）連續進樣6 次，以峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）來表征儀器的精密度。

采用已知維生素B1、維生素B2含量的樣品進行加標，以0.5、1.0、1.5 倍的3 個水平加標試驗，以外標法計算加標回收率和RSD，每個濃度值重復進樣3 次。

1.2.6 穩定性試驗

取同一供試樣品溶液，在室溫25 ℃條件下存放，每相隔24 h，按照1.2.2 方法進行試樣測定，連續測定3 d。

1.2.7 樣品測定

通過建立的HPLC 法對市場上2 種功能性維生素飲料中維生素B1、維生素B2含量進行測定，樣品平行測定2次。

1.3 數據處理

色譜數據分析采用儀器自帶軟件Agilent Chem－Station 進行處理。所有線性方程、精密度及回收率試驗的數據均由WPS Excel 2016 處理得出。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

參考張憬等[18]和張媛媛等[19]測定維生素B 的方法，得出246、267、280 nm 3 個理想波長數據，經過檢測發現，在280 nm 條件下同時測定維生素B1、維生素B2，基線穩定，組分出峰理想，故選擇280 nm 波長采集數據。

經相關文獻調研[20]，高效液相中比較常用的流動相一般為0.1%三氟乙酸（調節pH 值）-乙腈或甲醇-磷酸鹽緩沖溶液，但由于甲醇-磷酸鹽緩沖溶液體系中鹽濃度較高，如果試驗后不及時沖洗色譜柱會出現結晶，容易造成色譜柱堵塞，且對儀器要求較高，所以出于保護色譜柱，選用0.1%三氟乙酸-乙腈作為流動相進行試驗，試驗過程中樣品出峰時間短，并且峰形分離度高且對稱，無拖尾峰。

根據文獻[21]調研和考慮柱壓對色譜柱使用壽命的影響，在實際試驗操作中確定高效液相色譜的流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2 維生素B1、維生素B2 標準曲線

維生素B1、維生素B2混合標準工作溶液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，從低濃度到高濃度分別注入高效液相色譜儀，以標準物濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，分別繪制維生素B1、維生素B2的工作曲線如圖1，并計算回歸方程。結果得出維生素B1、維生素B2的線性方程分別為Y=8.145 9X+0.318 1，相關系數R2=0.999 98；Y=30.785X+0.121 5，相關系數R2=0.999 99；表明維生素B1濃度在0~80 μg/mL 范圍內具有良好的線性關系，維生素B2濃度在0~40 μg/mL 范圍內具有良好的線性關系。

2.3 維生素B1、維生素B2 檢出限和定量限

通過一系列梯度稀釋后，確定了維生素B1、維生素B2的檢出限分別為0.002 8、0.000 60 μg/mL，定量限分別為0.009 2、0.001 8 μg/mL，說明本檢測方法靈敏度較高。

2.4 精密度和回收率

通過對6 份同濃度的維生素B1、維生素B2混合標準品（維生素B1：16 μg/mL；維生素B2：8 μg/mL）連續進樣6 次，其峰面積及精密度見表2。

由表2 可知，維生素B1、維生素B2的RSD 分別為0.50%、0.77%，說明此法精密度較好，可適用于同時測定維生素B1、維生素B2。

通過對已知維生素B1、維生素B2含量的樣品進行加標，向已知樣品維生素B1加入0.60、1.20、1.80 mg/100 mL低、中、高3 個不同濃度的維生素B1標準品，向已知樣品維生素B2加入0.34、0.68、1.02 mg/100 mL 低、中、高3 個不同濃度的維生素B2標準品，以外標法計算，其加標回收率和RSD 見表3。

表3 加標回收率測試結果Table 3 Results of recoveries

由表3 可知，回收率在94.12 %~98.53 %之間，RSD 在0.32%~0.84%之間，說明此法重現性較好，可以被推廣。

2.5 穩定性試驗

通過對同一供試樣品溶液，在室溫25℃條件下存放，每相隔24 h，連續測定3 d，其檢測含量RSD 見表4。

表4 重現性試驗Table 4 The reproducibility experiments

續表4 重現性試驗Continue table 4 The reproducibility experiments

由表4 可知，樣品中維生素B1、維生素B2的檢測含量RSD 分別在4.67 %~5.86 %、0~1.64 %，平均值RSD 分別為0.47%、0.82%，說明供試樣品溶液在室溫25 ℃條件下放置3 d 后，樣品成分含量穩定，檢測方法準確可靠。

2.6 樣品測定

為了考察此方法的實用性，隨機對2 種功能性維生素飲料進行了分析，結果如表5 所示。

表5 樣品測定結果Table 5 The results of sample

由表5 可知，該方法同時測定維生素B1、維生素B2的相對偏差在1%~5%，說明檢測結果與實測結果較為接近，能滿足同時測定功能性飲料中維生素B1、維生素B2含量的要求。

維生素B1、維生素B2標準品及樣品色譜圖見圖2。

由圖2 可知，標準品中維生素B1、維生素B2的保留時間分別在2.620、10.108 min，樣品1 中維生素B1、維生素B2的保留時間分別在2.573、10.160 min，樣品2 中維生素B1、維生素B2的保留時間分別在2.641、10.331 min，表明本試驗建立的方法能確保使樣品與標準品中的檢測物質出峰時間相一致，偏差較少，建立的方法較好。

3 結論

目前中國逐步成為全球最大的飲料市場，不僅展現了巨大的發展潛力，更遑論未來的發展勢頭，而其中功能飲料和健康飲料將發揮更大的發展空間。市場上功能性飲料成分呈現多種多樣，單一成分檢測難以滿足現今實驗室檢測要求，因此本試驗通過建立高效液相色譜法同時測定功能性飲料中的維生素B1、維生素B2含量的方法，提高實驗室分析檢測效率。對色譜條件進行了試驗及優化驗證，以C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）為分離柱，用0.1%三氟乙酸和乙腈以不同比例混合進行梯度淋洗，使用紫外檢測器在280 nm處測定。結果表明，維生素B1、維生素B2的質量濃度分別在0～80 μg/mL、0～40 μg/mL 范圍內與其峰面積呈線性關系，R2分別為0.999 98、0.999 99，線性關系較好；檢測方法的精密度RSD 分別為0.50%、0.77%；樣品加入標準品后測得回收率分別在94.17 %～97.78 %、94.12%～98.53%之間，方法的最低檢出限分別為0.002 8、0.000 60 μg/mL，定量限分別為0.009 2、0.001 8 μg/mL；最后通過抽取兩個樣品進行檢測驗證，結果得出檢測相對偏差分別在2%～5%、1%～5%，檢測結果與實測結果較為接近，能滿足同時測定功能性飲料中維生素B1、維生素B2含量的要求。

圖2 維生素B1、維生素B2 標準品及樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of standard and sample of vitamin B1 and vitamin B2