草莓果生刺盤孢菌的生物學特性及致病性測定

宋麗麗，張麗勍，高清華，段 可*

（1上海海洋大學食品學院，上海201306；2上海市農業科學院林木果樹研究所，上海201403）

草莓炭疽病是嚴重威脅草莓生產的重要病害之一，發生普遍，分布廣泛，主要危害草莓的葉片、葉柄與匍匐莖，嚴重時病菌侵入短縮莖，致使整株凋萎、枯死［1］。草莓炭疽病屬于高溫病害，已成為中國南方草莓產區育苗的主要障礙［2-3］。2012年夏季，湖北省草莓炭疽病平均發病率為41.7%，嚴重田塊發病率高達 69%［4］。

膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是引起草莓炭疽病的病原菌之一。膠孢炭疽菌為復合種，Weir等［5］通過多基因聯合建樹的方法將膠孢炭疽菌復合種劃分為22個種和1個亞種。果生刺盤孢菌（C.fructicola）是膠孢炭疽菌復合種之一。Han等［6］研究發現，果生刺盤孢菌極易侵染草莓的葉片和葉柄，接種后30 d，草莓植株的死亡率達到77.8%。目前，國內對果生刺盤孢菌的研究多限于種的鑒定及其遺傳結構［7-9］，而針對果生刺盤孢菌的生物學特性及其防治的研究鮮有報道。本試驗對分離自上海和安徽地區，侵染草莓植株不同部位的果生刺盤孢菌菌株的生物學特性及其致病性進行分析和比較，以期初步了解果生刺盤孢菌的生長習性和致病機理，為進一步研究近年草莓炭疽病流行成因及綜合防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株分離自上海市和安徽省具有炭疽病典型癥狀的草莓病株，菌株編號及來源信息詳見表1。

表1 供試草莓炭疽菌菌株信息Table 1 Information of the tested strawberry anthrax strains

接種草莓材料為來自上海市農業科學院林木果樹研究所經過莖尖脫毒的組培苗‘章姬’（易感病）和‘申陽’（抗病）。

1.2 草莓炭疽病病原菌的分離與純化

將病樣采回后消毒處理，組織分離參考陳瑤等［10］的方法，處理后將組織置于加有氯霉素的PDA平板上，28℃暗培養3 d。切取菌落邊緣菌絲置于PDA液體培養基中，在搖床中28℃、200 r/min培養1 d。單孢劃線分離病原菌參考張昊等［11］的方法。單孢菌轉接到PDA平板上于28℃培養用于鑒定。

1.3 草莓炭疽病病原菌的鑒定

1.3.1 菌株形態特征觀察

對上海及安徽地區分離到的炭疽病菌進行形態觀察及比較。用打孔器沿菌落邊緣打取直徑為6 mm的新鮮菌餅，將菌餅轉接至PDA平板中央，于28℃恒溫培養5 d后觀察記錄菌餅直徑，每個菌株培養并觀察記錄5皿。參考Cox等［12］的方法搖菌配制適當濃度的孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察分生孢子及附著孢形態，每菌株至少觀察5個視野，重復3次。

1.3.2 分子鑒定

病原菌DNA的提取：刮取新鮮菌絲在液氮中磨碎，收集100 mg粉末，使用OMEGA E.Z.N.A.TMFungal DNA Miniprep Kits提取菌株基因組DNA。基因選擇及PCR擴增參考Weir等［5］的方法略有改動，退火溫度為ITS（55℃）、CAL（62℃）、ACT（61℃）、GAPDH（61℃）、ApMat（61℃），膠孢炭疽菌復合種種類劃分所用引物見表2。取5μL PCR產物，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR擴增產物序列測定委托生工生物工程（上海）有限公司進行。

表2 試驗所用引物Table 2 Primers used in the experiment

將測序結果經序列比對分析和手動修正，按照ITS-CAL-ACT-GAPDH-ApMat的順序首尾相連。下載GenBank中同時含有這5個基因的炭疽菌屬菌株序列及相關模式菌株序列［18］（表3），同樣按照ITS-CALACT-GAPDH-ApMat的順序首尾相連后進行分析。參照李河等［8］方法，選取C.hippeastri作為外群，使用MEGA 7.0軟件，采用最大似然法（ML）構建多基因序列的系統發育樹。

1.4 生物學特性分析

1.4.1 產孢量及孢子萌發測定

參考張敬澤等［19］的方法稍有改動，將培養7 d的菌落用直徑為10 mm的打孔器沿邊緣打孔，挑取8個菌塊置于30 mL PDA液體培養基中，在搖床28℃、200 r/min搖菌3 d。吸取20μL于載玻片上，在顯微鏡10×鏡下觀察記錄5個視野的產孢量。同上將孢子懸浮液制成1×106個/mL，取30μL于載玻片上，使孢子懸浮液的濃度為在顯微鏡10×鏡視野下每個視野含有45—50個分生孢子。放入墊有濕潤濾紙的培養皿中，置于黑暗條件下28℃恒溫培養箱中培養，每處理重復3次，在不同時間（3 h、6 h、24 h）觀察和統計孢子萌發率（孢子萌發率＝已萌發的孢子數/總孢子數）。

1.4.2 溫度對各菌株菌絲生長的影響

用無菌打孔器沿菌落邊緣打取直徑為6 mm的新鮮菌餅，將菌餅轉接至新的PDA平板中央后分別置于8個不同溫度梯度（5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）的恒溫培養箱中培養。5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3皿，重復3次。

1.4.3 pH對各菌株菌絲生長的影響

準備 1mol/LNaOH和1mol/LHCL溶液，將 PDA培養基的 pH分別調至3、4、5、6、7、8、9、10共8個梯度，用無菌打孔器沿菌落邊緣打取直徑為6 mm的新鮮菌餅，將新鮮菌餅置于不同pH的PDA平板中央，于28℃恒溫培養，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3皿，重復3次。

1.4.4 不同碳、氮源對各菌株菌絲生長的影響

參考陳秀蓉等［20］的方法，將直徑為6 mm的新鮮菌餅置于加有20 g/kg不同碳源的PDA培養基中央，或加有2.5 g/kg不同氮源的PDA培養基中央，以不加任何碳源或氮源為對照，于28℃恒溫培養，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3皿，重復3次。

1.5 致病性測定

選取經過莖尖脫毒的組培草莓苗‘章姬’（易感病）和‘申陽’（抗病），生根煉苗馴化后，移栽于基質中，在溫室培養1個月后，轉至HZLED-1000C型智能人工氣候箱（上海皓莊儀器有限公司），適應1周后采用噴霧法接種。將不同菌株分離獲得的分生孢子制成1×106個/mL的孢子懸浮液，均勻噴灑于草莓葉片上（以有水滴流下為度），以噴灑無菌水為對照［21-23］。每處理5株，3次重復。接種后的草莓植株置于培養箱（25℃）中黑暗覆膜保濕培養24 h，之后揭膜繼續正常培養（25℃，L/D＝12 h/12 h）。病情分級與不同菌株致病性等級的劃分參考王豐等［24］。

1.6 數據分析

利用SPSS 16.0和Excel 2010軟件進行生物統計分析，差異顯著性檢測采用鄧肯氏新復極差法進行；使用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 形態特征觀察

分離自上海及安徽草莓主栽區的6個炭疽菌菌株在PDA上培養5 d后，菌落形態存在一定差異。GQHAH1、GQHAH6、GQH26、GQH133、GQH131菌株菌落隆起，整個菌落疏松、絮狀，中心深灰或灰綠色，邊緣灰白整齊。GQHAH4菌株菌落較扁平、整個菌落較致密、絨毛狀、白色、邊緣整齊。分生孢子整體均呈長橢圓形或一端略尖，光滑，無色，分生孢子在水中萌發產生芽管后形成梨形、卵形等暗褐色的附著胞，胞內分布黑色顆粒狀物，附著胞形態較穩定，大小不均一（圖1）。

圖1 各菌株在PDA培養基（pH＝6.8）上生長5 d的菌落形態及40×鏡下觀察的孢子和附著胞形態Fig.1 Colony morphology of different strains after cultivation on PDA medium（pH＝6.8）for 5 daysand themorphology of spore and appressorium observed under 40×m icroscope

根據吳文平等［25］和 LIU等［26］對真菌的分類依據，初步鑒定該病原菌為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）。

2.2 菌株的分子鑒定

以6個膠孢炭疽菌菌株基因組DNA為模板，擴增ITS（615 bp）、ACT（316 bp）、GAPDH（308 bp）、CAL（756 bp）、ApMat（1 000 bp）基因，得到特異性條帶，符合測序要求（圖2）。

圖2 6個菌株的基因（ITS，ACT，GAPDH，CAL，ApMat）鑒定Fig.2 Identification of genes（ITS，ACT，GAPDH，CAL，ApMat）of 6 strains

使用5個基因（ITS、ACT、GAPDH、CAL、ApMat）的引物，分別擴增供試的6個病原菌，將PCR產物進行測序后，采用多基因聯合建樹法對其進行比較分析。結果顯示，6個草莓炭疽菌菌株與已報道的C.fructicola菌株號為 LC2924、LF131、LC2925、LF132、LC3670、ICMP10642、LF900、LC3368、LF590的菌株處在同一分支上，與已報道鑒定為C.fructicola的模式菌株ICMP18581及CBS130416歸在一個種群內（圖3）。多基因系統發育樹的結果結合病原菌形態特征分析表明，GQHAH1、GQHAH4、GQHAH6、GQH26、GQH133、GQH131病原菌均為草莓果生刺盤孢菌（C.fructicola）。

圖3 基于ITS、ACT、GAPDH、CAL和ApMat基因聯合構建炭疽菌的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic analysis of anthrax based on ITS，ACT，GAPDH，CAL and ApMat genes

2.3 果生刺盤孢菌的生物學特性分析

2.3.1 產孢量及孢子萌發率比較

如圖4所示，各菌株在同等條件下的產孢量存在差異。GQH26菌株搖菌3 d后的產孢量最多，達到291個，GQHAH4產孢量最少，為104個（圖4A）。GQH26和GQH131菌株的產孢量顯著高于其他菌株。不同菌株在3 h、6 h、24 h的孢子萌發率顯著增高，尤其在6—24 h間增長明顯。在24 h時，6個果生刺盤孢菌菌株的孢子萌發率接近100%（圖4B）。

圖4 不同菌株在搖菌3 d后的產孢量（A）及不同時間的孢子萌發率（B）Fig.4 Sporulation capacity of different C.fructicola strains after 3 days’culture（A）and spore germ ination rates（B）at different time

2.3.2 溫度對各菌株菌絲生長的影響

如表4所示，在10—35℃范圍內，6個果生刺盤孢菌菌株均能生長，當溫度低至5℃ 或高至40℃時，菌絲停止生長。當溫度為30℃時，不同菌株的菌落直徑均達到最大值，表明30℃是較適合草莓果生刺盤孢菌菌絲生長的溫度。

當溫度為15—35℃時，GQH131與GQHAH1、GQHAH4的菌落直徑有顯著差異；當溫度為10℃ 時，GQH26菌絲生長最快，菌落直徑為1.72 cm，GQH133菌絲生長最慢，菌落直徑為1.42 cm。由此可見，不同溫度對果生刺盤孢菌生長影響不同，這可能與不同菌株對溫度的適應不同有關。

表4 果生刺盤孢菌菌株在不同溫度下生長5 d后的菌落直徑Table4 Colony diameter of C.fructicola after cultivation for 5 days under different temperature cm

2.3.3 不同pH對各菌株菌絲生長的影響

如表5所示，pH 3—10時，草莓果生炭疽病菌均能生長，而最適菌株生長的pH為6—7。分離自上海的GQH26、GQH133、GQH131菌株在pH為6時菌落直徑最大，分離自安徽的GQHAH1、GQHAH4、GQHAH6菌株在pH為7時菌落直徑最大。可見，不同pH對不同的草莓果生刺盤孢菌菌株生長影響不同。

表5 果生炭疽病菌株在不同pH條件下生長5 d后的菌落直徑Table 5 Colony diameter of C.fructicola after cultivation for 5 days at different pH cm

2.3.4 碳源對各菌株菌絲生長的影響

供試菌株在葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇和乳糖為碳源的培養基中均能生長（表6），但菌絲直徑存在顯著差異。菌株GQH26、GQH131、GQH133、GQHAH1、GQHAH6對碳源的利用偏好順序為葡萄糖 ＞蔗糖＞麥芽糖＞甘露醇＞乳糖；GQHAH4對碳源的利用偏好順序為麥芽糖＞蔗糖＞葡萄糖＞甘露醇＞乳糖。同一碳源條件下不同菌株的菌落直徑有差異，其中以麥芽糖為碳源時，GQH131菌株菌落直徑最大，為7.28 cm，GQHAH1菌株菌落直徑最小，為5.92 cm。

表6 果生刺盤孢菌菌株在不同碳源條件下生長5 d后的菌落直徑Table 6 Colony diameter of C.fructicola after cultivation for 5 days w ith different carbon sources cm

2.3.5 氮源對各菌株菌絲生長的影響

如表7所示，菌株GQH26、GQH131、GQH133對氮源的利用偏好順序為銨鹽＞丙氨酸＞甘氨酸＞L-半胱氨酸＞尿素；GQHAH1、GQHAH4、GQHAH6對氮源的利用偏好順序為銨鹽＞甘氨酸＞丙氨酸＞L-半胱氨酸＞尿素。可見，氮源對不同果生刺盤孢菌菌株菌絲生長的影響存在差異。

表7 果生刺盤孢菌菌株在不同氮源條件下生長5 d后的菌落直徑Table 7 Colony diameter of C.fructicola after cultivation for 5 days w ith different nitrogen sources cm

2.3.6 不同果生刺盤孢菌菌株對草莓葉片的致病性測定

利用不同菌株接種處理易感病草莓品種‘章姬’和抗病品種‘申陽’（苗齡均為30 d），對不同菌株的致病性進行比較。結果表明（圖5），GQH131菌株對‘章姬’的致病力顯著高于其他菌株，病情指數達到61.98，而其他5個菌株的致病性無顯著差異。各菌株對抗病品種‘申陽’的致病性測定表明，GQH131菌株對其致病性顯著高于GQHAH1和GQHAH4，病情指數為45.45。可見，來源不同的果生刺盤孢菌菌株致病性存在一定程度的分化。

圖5 ‘章姬’草莓和‘申陽’草莓接種不同菌株9 d后的病情指數Fig.5 Disease index of‘Akihime’and‘Shenyang’strawberry inoculated w ith different strains for 9 days

3 討論

草莓是國內外重要的小水果之一，近年來隨著全國范圍內草莓種植面積的擴大，設施密閉及高溫高濕環境等導致草莓炭疽病發生日益嚴重，造成草莓減產25%—30%［27］，嚴重影響草莓的產量和品質。草莓炭疽病是草莓生產中的一種重要病害，草莓炭疽病的主要病原菌有草莓炭疽菌（C.fragariae）、膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）［28］，均為復合種群，群內種類多，種間菌株變異較大。

傳統的真菌分類主要基于形態學特征和ITS序列分析，但對于像炭疽菌屬這類近似種之間差異微小，且隨著寄主與病原菌之間相互協同進化，形態上的分類標準更為模糊［29］。同時，單一的ITS序列分析對多數近緣種和復合種構建的系統樹在一些關鍵進化節點的支持率較低，不能進行識別［30］。而多基因聚合鑒定比單基因鑒定更加有效，使得基因樹更能準確地推測物種，特別是近緣物種的系統關系［31］。采用傳統的形態學和ITS序列分析，對于研究膠孢炭疽菌這樣的復合種內的遺傳關系結果十分不可靠。本試驗利用多基因聯合建樹法對分離自上海和安徽不同組織器官的草莓炭疽病菌進行進一步的分子鑒定，結果顯示試驗菌株均與果生刺盤孢菌（C.fructicola）歸為一個種群。結合病原菌形態特征，鑒定試驗所用6個菌株為果生刺盤孢菌。

對果生刺盤孢菌生物學特性分析表明，草莓果生刺盤孢菌對溫度、pH等適應范圍廣，在溫度10—35℃及pH 3—10均能生長。較適溫度為25—30℃，溫度低于5℃或高于40℃時菌絲停止生長。本研究結果與張海英等［32］對草莓炭疽菌生物學特性的研究略有差異，張海英等認為草莓炭疽病病原菌最適溫度為25℃，這可能與不同來源及不同菌種的病菌對溫度的適應范圍不同有關。

本試驗發現草莓果生刺盤孢菌最適pH為6—7，與任小杰［33］對草莓炭疽菌的研究、楊成德等［34］對馬鈴薯炭疽病菌的研究結論一致。此外，本試驗表明，果生刺盤孢菌能利用多種碳氮源。在不同碳源中，各菌株對碳源的利用略有差異，其中葡萄糖和蔗糖較適合該菌的生長；在不同氮源中，菌絲在銨鹽培養基上生長最快，尿素培養基最慢。

從草莓果生刺盤孢菌接種抗病性不同的草莓品種‘章姬’和‘申陽’葉片后的病情指數來看，不同菌株的致病力存在一定差異。對易感品種‘章姬’的致病性顯示，GQH131與其他5個菌株有顯著差異；而對抗病品種‘申陽’的致病性僅GQH131與GQHAH1、GQHAH4有顯著差異。說明來源不同的菌株在進化過程中，其致病性產生了一定程度的分化，且不同品種的草莓對菌株的抗病性存在差異。

本研究可為生產上防治草莓炭疽病提供參考，當溫度為25—30℃ 時，需加強對該病害的防控。Freeman等［35］報道，炭疽病可在無菌的土壤中存活至少1年，這與其廣泛的適應性有關。另外，不同草莓果生刺盤孢菌在生物學特性也有一定差異，生產上應該因地制宜地指導不同地區草莓果生刺盤孢菌的科學防控。本研究分離菌株數量有限，關于不同來源的草莓果生刺盤孢菌生物學特性和致病性分化情況，尚待大量收集不同地區的病原菌，結合室內觀測和田間小區試驗進行深入研究，以此更好地指導田間種植防護工作。