非小細胞肺癌患者化療后血漿循環腫瘤DNA水平與預后的相關性

龍 濤 郎 松

(中國人民解放軍陸軍軍醫大學附屬新橋醫院腫瘤科,重慶市 400037,電子郵箱：longtao198406@sina.com)

肺癌是全球癌癥患者死亡的主要原因[1],每年造成約130萬人死亡[2],其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺部惡性腫瘤的80%以上,并且大多數患者在發病時已處于疾病晚期[3]。盡管手術及放化療技術在不斷進步,但NSCLC患者的5年生存率仍低于20%[4]。因此,如何對NSCLC的臨床療效及預后進行評估,是目前亟待解決的問題。循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是一種基于血液的敏感生物標記物,在監測晚期癌癥中具有較高的臨床價值[5]。ctDNA水平可反映腫瘤負荷,有助于監測腫瘤對治療的反應；此外,ctDNA突變也可以反映腫瘤對特定化療藥物的敏感性[6]。本研究分析NSCLC患者化療后ctDNA水平與預后的相關性,現將結果報告如下。

1 資料及方法

1.1 臨床資料 納入2017年1月至2018年1月于我院進行化療的77例NSCLC患者。納入標準：原發性NSCLC患者,經病理學診斷明確。排除標準：(1)合并其他部位腫瘤；(2)合并心、腦、腎等臟器嚴重病變；(3)合并各種急、慢性感染；(4)嚴重精神疾病、神經系統疾病患者。根據腫瘤是否進展將患者分為進展組29例及無進展組48例。兩組患者的年齡、性別等一般資料比較,差異均無統計學意義(均P>0.05),見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 觀察指標 所有患者均予NSCLC標準化療方案,如順鉑或卡鉑聯合吉西他濱等一線化療方案,于化療方案結束后1周檢測患者以下指標。

1.2.1 癌胚抗原、糖類抗原125、神經元特異烯醇化酶水平測定：所有患者均于清晨抽取空腹靜脈血4 mL,混勻后以3 000 r/min離心10 min,分離血清,放置于-20℃冰箱內備用；采用電化學發光免疫分析法檢測癌胚抗原、糖類抗原125、神經元特異烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE),儀器為i2000型全自動化學發光免疫分析儀(美國雅培公司),試劑為同廠配套產品(批號：S20160241),操作過程嚴格按照說明書進行。

1.2.2 ctDNA水平測定：(1)樣本收集。所有患者均于清晨抽取空腹靜脈血2 mL,于標本采集后2 h內進行離心(3 000 r/min,10 min),將上清血漿部分吸至潔凈離心管,繼續離心(3 000 r/min,10 min)完全去除血細胞成分后置于干燥潔凈凍存管中,置于-80℃冰箱保存備用。(2)血漿ctDNA抽提及純化。嚴格按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國Qiagen公司)試劑盒的操作步驟進行血漿DNA的抽提,每2 mL血漿可獲得300 μL的DNA。(3)ctDNA定量分析。采用pH 7.0～8.5的緩沖液將熒光染料SYBR Green Ⅰ(美國Molecular Probes公司)稀釋成1 ∶3 000的濃度備用。取10 μL血漿DNA置于透明載板上,與1 ∶3 000熒光染料SYBR Green Ⅰ等比例稀釋并充分混勻后置于紫外與可見光成像分析系統(美國賽默飛公司)中,在激發光波長為345 nm、吸收波長500 nm的條件下,攝影獲取圖像,經軟件系統分析讀取其發光強度。將不同樣本DNA的發光強度代入根據標準含量DNA 的發光強度所做的回歸方程(Y=133.17+39.458X),分別計算其相應的DNA 濃度。如果樣本發光強度超過標準DNA發光強度范圍,則將樣本稀釋后再進行定量,直到所測值在標準濃度范圍內。每次對同一血漿樣本檢測3次,取其平均值。

1.3 隨訪 化療結束后對所有患者進行隨訪。前6個月內每2個月進行1次門診隨訪,之后每6個月進行1次門診隨訪(主要復查肺CT)。隨訪截止日期為2019年1月。若患者病情出現復發、轉移或死亡則記為疾病進展；記錄患者的疾病進展情況。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用t檢驗；計數資料以例數(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗；應用Cox回歸模型分析患者疾病進展的獨立危險因素；應用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評估不同指標預測患者疾病進展的效能,采用DeLong法比較曲線下面積(area under the curve,AUC)的差異。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組化療后癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平比較 化療后,進展組患者的癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平均高于未進展組(均P<0.05),見表2。

表2 兩組化療后血癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平比較(x±s)

2.2 NSCLC患者化療后疾病進展的影響因素 以癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平為自變量(均為連續變量),以疾病進展為因變量(無進展=0,進展=1),進行多因素Cox回歸。結果顯示，癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平升高均是NSCLC患者化療后疾病進展的獨立危險因素(均P<0.05),見表3。

表3 NSCLC患者化療后疾病進展的影響因素分析

2.3 不同指標預測NSCLC患者化療后疾病進展的診斷效能 應用ctDNA預測NSCLC患者化療后疾病進展的AUC高于癌胚抗原、糖類抗原125、NSE(z=3.198,P=0.001;z=3.657,P<0.001;z=4.978,P<0.001)。其中,ctDNA的最佳截點為29.50 μg/L,此時其預測NSCLC患者化療后發生進展的敏感性為100.00%,特異性為97.92%,均高于其余指標。見圖1及表5。

圖1 不同指標預測NSCLC患者化療后疾病進展的ROC曲線

表5 不同指標預測NSCLC患者化療后疾病進展的效能

3 討 論

肺癌是導致世界上癌癥相關死亡人數最多的惡性腫瘤,其中大多數肺癌為NSCLC(占85%)[7]。盡管腫瘤學科在不斷發展,手術及放化療等治療技術在不斷完善,NSCLC患者的預后仍不樂觀,NSCLC患者的總體5年生存率仍然很低,約為16%[8]。目前NSCLC的治療仍以手術、放化療治療為主,其中NSCLC術后5年生存率不足15%[9]。

目前,臨床常用癌胚抗原、糖類抗原125、NSE等血液學指標對NSCLC患者治療的臨床療效及預后進行預測。癌胚抗原是多種癌癥中最常用的腫瘤標志物[10]。癌胚抗原相關細胞黏附分子5在各種惡性腫瘤中持續過度表達,與患者的不良臨床結果和總體存活率降低相關,因此其成為一種突出的臨床癌癥生物標志物,廣泛用于早期診斷[11]。但癌胚抗原相關細胞黏附分子5的敏感性和特異性不高,且臨床適用性相對有限[12]。糖類抗原125是一種黏液性糖蛋白，與NSCLC疾病發生、發展相關[13]。Díez等[14]曾報告,術前血清糖類抗原125水平與可手術的NSCLC患者的TNM分期有關,可提供額外的預后信息,且血清糖類抗原125水平是監測腫瘤復發和術后播散的指標。NSE是一種糖分解烯醇酶,由神經元及神經內分泌細胞分泌，在NSCLC中具有較好的敏感性及特異性，目前被認為是NSCLC預后不良的標志,部分NSCLC患者NSE水平升高,而這可能與預后不良有關[15]。然而上述指標的診斷效能較低,故目前臨床提出通過監測ctDNA對患者的預后進行評估。

ctDNA是腫瘤細胞釋放到血液中的單鏈或雙鏈DNA,攜帶有原始腫瘤的突變基因。已知的ctDNA的基因組譜與相應腫瘤的基因組譜匹配度高,并由于其檢測具有可再現、非侵入性和易于獲得等特征，在肺癌的管理中起著至關重要的作用[16]。近年來的研究表明,ctDNA篩查可顯著改善目前的腫瘤診斷系統,甚至有助于腫瘤的早期診斷[17]。ctDNA水平的波動與多種因素相關,其中包括腫瘤類型、進展、治療效果和轉移擴散[18]。近期,Chen等[19]發現,ctDNA能夠實時敏感地反映NSCLC患者的腫瘤基因突變信息及腫瘤負荷,可用于監測患者術后微小病灶的殘留,并評估腫瘤復發的相關風險。本研究結果顯示,化療后進展組患者的癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平均高于未進展組(均P<0.05),且癌胚抗原、糖類抗原125、NSE及ctDNA水平升高均是化療后NSCLC患者疾病進展的獨立危險因素(均P<0.05)。這提示ctDNA與臨床常用的血液腫瘤標志物均可用于化療后NSCLC患者的預后評估。而進一步ROC曲線分析結果顯示,應用ctDNA預測NSCLC患者疾病進展的AUC達0.999,敏感性為100.00%,特異性為97.92%,均高于癌胚抗原、糖類抗原125和NSE,表明ctDNA對化療后NSCLC患者預后的預測效能較高,且優于傳統的血液腫瘤標志物。

綜上所述,ctDNA在評估化療后NSCLC患者預后方面具有較高的效能,值得臨床使用。但ctDNA檢測價格相對較高,且檢驗程序復雜,難以做到臨床推廣。此外,本研究僅納入我院化療的NSCLC患者,且僅對單一指標進行相關性分析。因此,還應繼續行大樣本、多中心的臨床試驗,并應進一步比較多種指標聯合檢測與ctDNA單一檢測在評估NSCLC化療患者預后方面的效能及價值。