蛹蟲草對小鼠細胞免疫及巨噬細胞吞噬功能影響

張偉云， 王 玉， 王旭東， 王志兵*

(1.長春工業大學 化學與生命科學學院， 吉林 長春 130012;2.吉林省中醫藥科學院, 吉林 長春 130021)

0 引 言

蛹蟲草為子囊菌門，肉座目，麥角菌科，蟲草屬的模式種，又名北蛹蟲草。蛹蟲草分布廣闊，在四川、遼寧、貴州、廣東、吉林、河北、陜西、湖北、云南、廣西、福建、安徽等地均有生長。蛹蟲草功效同冬蟲夏草的功效近似。并且藥化、藥理試驗以及臨床試驗證明，蛹蟲草可以作為冬蟲夏草的代用品[1]。其功效成分主要包括氨基酸及蛋白質類、糖類、核苷酸類、蟲草酸、生物堿類、SOD等化學物質[2]。蛹蟲草具有抗菌、抗腫瘤及免疫調節等重要作用[3]。研究表明，蛹蟲草對于荷瘤小鼠或荷肝癌小鼠的免疫功能有顯著增強作用[4-5]。蛹蟲草對免疫低下模型小鼠有增強免疫力作用[6-8],可以恢復因運動引起的T淋巴細胞免疫抑制[9]。蛹蟲草對輻射小鼠的免疫損傷有保護作用[10]。綜上可知，蛹蟲草在免疫抑制、損傷方面的研究較多，對正常機體免疫能力的影響研究較少，本實驗通過對正常小鼠遲發型變態反應(DTH)、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗、ConA誘導的脾淋巴細胞轉化試驗、小鼠碳廓清試驗，觀察蛹蟲草在細胞免疫功能和巨噬細胞吞噬功能的影響。旨在分析蛹蟲草對正常機體內免疫能力的影響，并為其功能物質基礎的深入研究以及醫藥和保健食品方面研發提供實驗數據支持。

1 材料和方法

1.1 樣品

蛹蟲草粉，由鐵嶺市云欣蟲草生物有限公司提供。人體每60 kg推薦劑量1.0 g。

1.2 實驗動物

雄性KM小鼠，體重18～20 g，SPF級，由遼寧長生生物技術有限公司提供。動物室環境條件：溫度19～23 ℃，相對濕度40%～65%。

1.3 劑量分組

按人體推薦量 5、10、20 倍的劑量設計，最終設三個劑量組，分別為83.3、166.7、333.3 mg/(kg·BW)，配制方法：稱取受試物8.33、16.67、33.33 g，分別用蒸餾水定容至 2 000 mL，混勻，低溫保存，蒸餾水為對照組。每天按20 mL/(kg·BW)灌胃給藥。依據不同試驗將小鼠分四組,每組包括對照組及供試品低、中、高劑量組。

1)實驗一組：ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗；

2)實驗二組：遲發型變態反應實驗；

3)實驗三組：淋巴器官/體重比值測定和碳廓清實驗；

4)實驗四組：小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗。

小鼠連續灌胃30 d，之后開展試驗。

1.4 主要儀器和試劑

細胞離心管、96孔微量血凝實驗板、T1000型電子天平、血細胞計數板、SG-603生物安全柜、550型酶標儀、LD5-2A離心機、HH-4數顯恒溫水浴鍋、打孔器、二氧化碳培養箱、JJ-100電子天平、顯微鏡、JA2003型電子天平。

2,4二硝基氟苯DNFB、2%綿羊紅細胞SRBC、小牛血清、印度墨汁、RPMI1640培養液、刀豆蛋白ConA、MTT、異丙醇、硫化鋇。

1.5 實驗方法[11-13]

參照《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版):

1)ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化試驗。無菌取脾，置于盛有無菌Hank’s液平皿中，將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經200目篩網過濾，用Hank’s液洗2次，每次離心10 min(1 000 r/min)。然后將細胞懸浮于1 mL的完全培養液中，用臺酚蘭染色計數活細胞數，調整細胞濃度為3×106個/mL。將每一份脾細胞懸液分兩孔加入24孔培養板中，每孔1 mL，一孔加75 μL ConA液，另一孔作為對照，置 5%CO2，37 ℃ CO2孵箱中培養72 h。培養結束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMIl640培養液，同時加入MTT(5 mg/mL)50 μL/孔，繼續培養4 h。培養結束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養板中，每個孔作3個平行孔(100 μL/孔)，在570 nm波長采用酶標儀測定光密度值。

2)二硝基氟苯(DNFB)誘導遲發型變態反應(DTH)。小鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約3 cm×3 cm，之后采用1%DNFB(試驗前稱取DNFB 50 mg，置清潔干燥帶蓋小瓶中，加入丙酮油溶液[丙酮∶麻油=1∶1]5 mL)50 μL均勻涂抹致敏小鼠后,第5天再用DNFB涂抹右耳兩面進行攻擊 ,24 h后處死動物，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm的耳片,稱重，以左右耳的重量之差來表示DTH的程度。

3)小鼠碳廓清試驗。按體重從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁(取印度墨水原液12 mL+生理鹽水48 mL共稀釋液60 mL，反復震蕩混勻)，待墨汁注入，立即計時，注入墨汁后2、10 min，分別從內眥靜脈叢取血20 μL，并立即將其加到2 mL 0.1% Na2CO3溶液(稱取Na2CO30.2 g，加蒸餾水至200 mL。溶液分裝到82支小試管中，每只2 mL)中。各吸0.1 mL于96孔酶標板中，用酶標儀在600 nm波長處測光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死,取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重。以吞噬指數表示小鼠碳廓清的能力。

4)腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗。半體內法:制備20%的雞紅細胞懸液；每只鼠腹腔注射雞紅細胞懸液1 mL,間隔30 min，脫臼處死動物,將其仰位固定于鼠板上,正中剪開腹壁皮膚，經腹腔注入生理鹽水2 mL，轉動鼠板1 min。之后打開腹腔并吸出腹腔洗液1 mL,平均分滴于2片載玻片上,將加入腹腔液的載玻片小心放入墊有濕紗布的盒內，37 ℃溫育30 min；孵育結束用生理鹽水漂洗, 晾干,以1∶1的丙酮甲醇溶液固定5 min,再用4%Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min, 蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計數100個巨噬細胞,計算吞噬率和吞噬指數。

1.6 數據處理及結果判定

通常采用方差分析進行數據處理，進行方差齊性檢驗，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計；對方差不齊或非正態數據進行變量轉換，滿足正態或方差齊后進行統計；若變量轉換后仍未滿足正態或方差齊，則采用秩和檢驗。

2 結 果

2.1 一般毒性觀察

在30 d灌胃過程中，小鼠呼吸平穩、皮毛光滑、活動正常、口鼻處無明顯可見分泌物，實驗中小鼠無死亡。蛹蟲草對小鼠體重無明顯影響，各劑量組與對照組比較P>0.05，表明蛹蟲草灌胃后小鼠發育正常，未見明顯與受試物相關的毒性反應，見表1～表4。

表1 實驗一組試驗前后小鼠體重變化

表2 實驗二組試驗前后小鼠體重變化

表3 實驗三組試驗前后小鼠體重變化

表4 實驗四組試驗前后小鼠體重變化

2.2 蛹蟲草對動物淋巴器官/體重比值的影響

蛹蟲草對小鼠胸腺/體重比值和脾臟/體重比值無明顯影響，各劑量組與對照組比較均為P>0.05。蛹蟲草對動物淋巴器官/體重比值的影響見表5。

表5 蛹蟲草對小鼠淋巴器官/體重比值的影響

2.3 蛹蟲草脾淋巴細胞轉化試驗結果

蛹蟲草中、高劑量組可以顯著性增強ConA誘導的脾淋巴細胞增殖能力，與對照組比較P<0.05，見表6。

表6 蛹蟲草對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化功能的影響

2.4 蛹蟲草對小鼠遲發型變態反應的影響

蛹蟲草中、高劑量組可以顯著增強小鼠遲發型變態反應，與對照組比較P<0.05，見表7。

表7 蛹蟲草對小鼠遲發型變態反應的影響

2.5 蛹蟲草碳廓清試驗結果

蛹蟲草各劑量組均能顯著提高小鼠碳廓清吞噬指數，與對照組比較P<0.05，見表8。

表8 蛹蟲草對小鼠碳廓清功能的影響

2.6 蛹蟲草腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗結果

蛹蟲草中、高劑量組能顯著提高巨噬細胞吞噬指數及吞噬率，與對照組比較P<0.05，見表9。

表9 蛹蟲草對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

3 討 論

冬蟲夏草是名貴的傳統中藥，具有補肺、腎,益精填髓功效。大量研究表明,蛹蟲草可以作為冬蟲夏草的替代品[14]。

我們對鐵嶺市云欣蟲草生物有限公司提供的蛹蟲草進行細胞免疫功能和巨噬細胞吞噬功能方面的研究，細胞免疫是免疫系統的重要組成之一，可以通過控制自身抗體的產生，達到修復免疫損傷以及自身免疫調節的作用。從實驗中可以看出,中、高劑量組能顯著性增強ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖能力(P<0.05),顯著性增強二硝基氟苯誘導的小鼠遲發型變態反應(P<0.05)，說明蛹蟲草可以明顯增強小鼠細胞免疫能力。

巨噬細胞作為參與機體非特異性免疫反應的免疫細胞，具有極強吞噬功能。不僅可以發揮免疫防御作用，也可以在免疫應答中實施免疫調節作用，因此巨噬細胞吞噬能力是機體免疫強度的重要指標。本實驗在巨噬細胞吞噬功能方面選擇腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗和小鼠碳廓清試驗。發現蛹蟲草各劑量組均能顯著性增強小鼠碳廓清能力(P<0.05)；中、高劑量組可以顯著性增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞功能(P<0.05)。說明蛹蟲草可以顯著提高小鼠巨噬細胞吞噬功能。

蛹蟲草作為傳統中藥具有悠久的食用歷史，其食用價值和藥理作用受到越來越多的學者認可，其中免疫調節方面也有較多研究，但筆者發現蛹蟲草的免疫研究主要集中在免疫抑制、損傷方面，對正常機體免疫能力的影響研究較少。本研究結果旨在分析蛹蟲草對正常機體內免疫能力的影響,并為其功能物質基礎的深入研究以及醫藥和保健食品方面研發提供實驗數據支持。