蛋白翻譯后修飾與腸易激綜合征

王玥梅，朱遠冰，吳巧鳳，2，3△

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種胃腸道功能障礙性疾病，以反復腹痛、腹脹、糞便形態異常或排便規律改變等為主要臨床表現［1］。IBS由多種因素引發，腸道反應性變化（包括運動功能和分泌功能異常）、腸道感染和菌群失調、內臟高敏感性、腦-腸軸功能紊亂、心理壓力等因素可能與IBS有關或參與IBS的發病機制［2］。蛋白翻譯后修飾（post-translational modifications，PTMs）是蛋白質功能調節的一種重要方式，指蛋白質在翻譯后發生的化學變化，主要由識別特定蛋白質中特定靶序列的酶催化［3］，與許多重要的生命活動、疾病發生密切相關［4-5］。研究發現，人類細胞中的蛋白質存在不同類別的PTMs，在生理和病理條件下，PTMs能夠影響蛋白的穩定性、活性、定位以及信號轉導等不同方面，迅速調節細胞內生命活動，同時豐富蛋白功能的多樣性［6-7］。多種PTMs如乙酰化、磷酸化、甲基化等通過對相關蛋白分子的修飾及通路的活化在調節IBS內臟超敏、腸黏膜屏障、腸道免疫細胞等方面起重要作用。深入探索PTMs與IBS的關系對明確該疾病發生機制、治療靶標等方面均有重要意義。現就幾種蛋白修飾類型及其在IBS中作用的研究進展概述如下。

1 乙酰化修飾與IBS

乙酰化修飾是將乙酰基轉移到目標蛋白氨基酸側鏈基團上的過程。蛋白乙酰化修飾主要發生在賴氨酸NH3

+基團上，作為一種可逆的PTMs，它通常由賴氨酸乙酰化酶（lysine acetyltransferase，KAT）和賴氨酸去乙酰化酶（lysine deacetyltransferase，KDAT）調控，目前研究顯示組蛋白上的賴氨酸殘基乙酰化修飾主要在染色質結構和核小體動力學的調節中起重要作用［8］。乙酰化修飾最先在組蛋白上被發現，兩種催化酶也被稱作組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）。在HAT或HDAC的催化下，乙酰基團可在組蛋白賴氨酸殘基上添加或去除，分別增強或抑制DNA的轉錄水平。乙酰化修飾主要在核內或胞內發揮各自功能，在細胞生長、衰老、炎性反應等過程中發揮關鍵作用［9］。

研究發現，乙酰化修飾與IBS的相關性主要體現在內臟超敏性方面。內臟高敏感性是IBS重要發病因素，IBS患者中33%～90%表現為以痛覺過敏和異常性疼痛為特征的內臟超敏反應［10］。在反復應激或皮質酮水平改變誘導的內臟超敏反應中，通過改變大腦和脊髓中的組蛋白乙酰化水平，可導致促傷害性和抗傷害性基因表達產生特定變化，且HDAC抑制劑有可能成為IBS相關的內臟超敏反應癥狀的潛在治療方法［11］。

組蛋白乙酰化修飾在杏仁核介導的應激性內臟超敏機制中有重要作用，這一作用與下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）有密切關系。HPA軸在下丘腦啟動，下視丘室旁核有可以進行神經內分泌的神經元，該神經元可合成并分泌促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH），作用于垂體前葉，促進促腎上腺皮質激素（ACTH）的釋放。腎上腺皮質在ACTH的作用下合成糖皮質激素（主要是皮質醇）釋放入循環后，皮質醇與糖皮質激素受體（GR）結合，作用于下丘腦和垂體（分別抑制CRH和ACTH的合成與分泌），形成反饋調節環路。相反，皮質醇與杏仁核GR的結合可促進HPA軸，從而導致持續的應激活化，不僅誘導內臟產生超敏反應，而且使GR啟動子處組蛋白3的乙酰化水平下降［11］。GR啟動子區域組蛋白乙酰化的降低導致杏仁核中央核（CeA）內GR表達減少，隨后由于GR介導的抑制作用喪失，使CRH的表達增加［11］。而通過雙側CeA灌注HDAC抑制劑如三環素A或亞甲酰苯胺氫肟酸可減輕內臟超敏反應［12］。同時在IBS患者中發現，GR表達水平改變或杏仁核中CRH分泌的增加對杏仁核介導的HPA軸具有促進作用［13］。生命早期應激（early life stress，ELS）引起的新生兒內臟痛敏反應與CeA中CRH表達水平的增加密切相關［14］。Louwies等［15］發現ELS增加了成年雌性大鼠CeA中組蛋白3賴氨酸9（H3K9）乙酰化水平，CRH啟動子上的H3K9乙酰化增加，GR結合減少。CeA中組蛋白乙酰化失調與CRH啟動子GR結合失調是早期應激介導成年內臟痛敏的重要機制。因此ELS可能通過增加CRH啟動子處的H3K9乙酰化水平，導致CeA中CRH的上調，從而導致內臟超敏反應。研究發現鞘內注射HDAC抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸可減輕應激引起的雌性大鼠內臟超敏反應，改善其排便情況［16］。有研究表明使用該抑制劑后可增加脊髓谷氨酸受體（glutamate receptors）mGluR2和mGluR3的表達，揭示組蛋白乙酰化修飾可調節脊髓中mGluR2/3的表達，以緩解應激誘發的內臟超敏反應［17-18］。此外，組蛋白去乙酰基酶抑制劑曲古抑菌素A經腦室給藥可顯著抑制成年大鼠多次避水脅迫后所致的IBS內臟超敏反應［19］。由此可見，乙酰化修飾在IBS疾病發生發展中有不可忽視的地位。

2 甲基化修飾與IBS

生物體中甲基化經甲基轉移酶和去甲基化酶催化，共同參與形成和維系不同的甲基化狀態，涉及基因表達調控、蛋白質功能調節及RNA加工等生命活動，與炎癥、腫瘤、阿爾茨海默病等許多疾病發生發展緊密相關。常見的甲基化分類主要包括DNA甲基化和組蛋白甲基化，以及逐漸作為研究熱點之一的RNA甲基化。組蛋白甲基化一般發生在H3和H4組蛋白N端精氨酸或者賴氨酸殘基上，賴氨酸甲基化主要由包含SET結構域的甲基轉移酶催化完成，常發生在組蛋白H3賴氨酸第4、9、27、36、79位殘基（H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79）和組蛋白H4賴氨酸第20位殘基（H4K20）。同時，H3K4、H3K36、H3K79的甲基化常與基因轉錄激活相關，而H3K9、H3K27、H4K20的甲基化與基因轉錄抑制作用相關［20］。精氨酸甲基化主要由蛋白精氨酸甲基轉移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）催化完成。Chen等［21］研究發現基因組某一啟動子組蛋白H3第4位賴氨酸殘基三甲基（H3K4me3）可增強基因轉錄，而同一組蛋白H3的第9和27位賴氨酸殘基上三甲基化（H3K9me3和H3K27me3）抑制了基因的表達。在IBS甲基化全基因組分析研究中發現，和空白對照組相比，IBS模型組差異表達基因中Notch信號明顯增強，黏著斑明顯增加，并且在它們的啟動子區域中共有541個基因的甲基化水平明顯較低，而626個基因的甲基化水平明顯較高［22］。Mahurkar等［23］檢測IBS患者外周血單核細胞（PBMC）DNA甲基化水平，鑒定出133個差異性甲基化位點，類型主要與氧化應激和神經肽激素活性有關。同時研究人員通過測序驗證了谷胱甘肽-s-轉移酶mu5（GSTM5）和促進蛋白基因聚合的微管蛋白的甲基化水平差異性，且GSTM5中2個啟動子CpG的甲基化與表觀遺傳沉默相關。由此可見，在IBS發生發展過程中，甲基化修飾有著十分重要的地位。

甲基化參與基因表達調控在持續影響IBS內臟高敏性的潛在機制研究中有重要作用，應激誘導的IBS內臟痛與腦內DNA甲基化改變有關，導致前傷害性神經遞質表達增加［24］。兒童早期創傷作為壓力應激也是影響IBS內臟高敏性因素之一，其通過促使糖皮質激素受體基因的高度甲基化，降低糖皮質激素受體的表達，從而降低HPA軸應對壓力的有效調控。在IBS的動物模型中發現糖皮質激素受體啟動子發生甲基化，糖皮質激素受體基因表達降低，皮質酮水平持續升高［25］。研究發現，在IBS大鼠結腸組織中，甲基化CpG結合蛋白（methyl-CpG binding protein）MeCP2隨著血漿同型半胱氨酸和腸上皮細胞緊密連接（tight junctions，TJ）蛋白claudin-1基因甲基化程度的升高而升高，說明MeCP2可能和claudin-1基因甲基化共同抑制了基因的轉錄和表達［26］。因此，甲基化修飾在IBS內臟高敏發生中有著重要的作用。

3 磷酸化修飾與IBS

磷酸化修飾具有可逆地修飾真核細胞蛋白質的特性。目前發現在人類細胞中已有超過500種蛋白激酶產生巨大的磷酸化蛋白質組，其中包括約20萬個單獨的磷酸化位點，并且這個數字還在不斷增加［27］。磷酸化修飾通過蛋白質激酶和磷酸酶分別參與蛋白磷酸化與去磷酸化，參與調控信號轉導、翻譯調控以及新陳代謝等重要生命活動［28］。蛋白質激酶可催化腺苷三磷酸（ATP）中的磷酸基團轉移到氨基酸側鏈上的蛋白底物上，而磷酸酶則可催化磷酸基團的移除，磷酸基團帶有負電荷，因此磷酸化與常染色質松弛相關，可促進基因的轉錄［29］。磷酸化修飾與炎癥、免疫、腫瘤等密切相關，Western blot是檢測蛋白表達較為靈敏和特異的方法，隨著同位素標記、免疫印跡-化學發光等作為核心的磷酸化蛋白質分析方案的不斷完善和更新，對磷酸化修飾在疾病中的機制研究也更為清晰與深入［30-31］。

在IBS模型小鼠腦腸軸，即在下丘腦、垂體、結腸中辣椒素受體（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）的表達增多，TRPV1上調及磷酸化被認為是介導痛覺敏化并引發IBS內臟高敏感性的關鍵性事件之一，蛋白酶激活受體2-蛋白激酶C（PAR2-PKC）通路可通過調控TRPV1磷酸化，激活TRPV1，使TRPV1開放閾值下降，Ca2+內流增加，導致神經末梢去極化，釋放神經肽類和興奮性氨基酸，從而引發內臟疼痛感知異常，最終導致IBS內臟高敏感性的發生［32］。同時TRPV1可被磷酸鈣酶（包括鈣調神經磷酸酶）負調節。Matsui等［33］發現鈣調神經磷酸酶抑制劑他克莫司可使TRPV1介導的脊髓細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）磷酸化水平升高，從而加重小鼠TRPV1依賴性結腸超敏反應。此外，腸屏障功能障礙是IBS的關鍵病因，Rodi?o-Janeiro等［34］研究發現腹瀉型腸易激綜合征患者空腸中睪丸特異激酶1（TESK1）介導的編碼肌動蛋白1（CFL 1）磷酸化降低，這可能是女性IBS患者腸上皮功能障礙易感性增加的原因。Li等［35］發現二甲雙胍干預可抑制IBS大鼠結腸組織肥大細胞活化，從而降低PAR-2表達，抑制絲氨酸位點的ERK活化和腸上皮細胞TJ蛋白claudin-4磷酸化，減輕結腸擴張所致的內臟超敏反應，說明磷酸化修飾可能參與二甲雙胍改善IBS腸黏膜屏障功能的機制。此外，一項含麩質飲食（gluten-containing diet，GCD）改善IBS-D（腹瀉型）患者癥狀與腸道通透性的研究顯示，使用GCD干預后，患者小腸上皮肌球蛋白Ⅱ調節輕鏈（MLC）磷酸化增加，并與結腸通透性增高相關［36］。Zhang等［37］發現與健康對照者相比，IBS患者結腸黏膜層中熱休克蛋白27（HSP27）高表達，而脂多糖（LPS）刺激可促使HSP27在結腸上皮細胞中的表達，并且使HSP27在絲氨酸78和82位點發生磷酸化，隨后采用沉默小干擾RNA驗證了HSP27的磷酸化可能通過調節NF-κB通路來保護腸上皮細胞免受損害。因此，磷酸化修飾在IBS內臟高敏性和腸屏障功能障礙的機制研究中有著重要作用。

4 糖基化修飾與IBS

糖基化修飾是常見的PTMs方式之一，也是蛋白質翻譯后的一種重要的加工過程［38］。蛋白糖基化是在肽鏈合成的同時或合成后，通過糖基轉移酶催化，使糖與多種蛋白質氨基酸殘基結合形成糖苷鍵，而后形成糖蛋白，參與機體內細胞黏附、分子識別以及信號轉導等過程，其起始于內質網，結束于高爾基體，對蛋白質行使生物學功能起著重要作用［39-40］。糖基化修飾根據糖蛋白糖側鏈與蛋白氨基酸基團的不同連接方式，主要分為N-連接糖基化（N-linked glycosylation）和O-連接糖基化（O-linked glycosylation）兩大類，而O-連接糖基化又包括OGalNAc、O-GlcNAc、O-Man、O-Fuc、O-Xyl、O-Gal、O-Glc等，以O-GalNAc、O-GlcNAc的研究較為深入。蛋白糖基化在IBS疾病中的研究較少，而在腸道細胞研究中較為廣泛，有研究表明糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGE）及其受體（eceptor for advanced glycation end products，RAGE）在腸道L細胞中有重要作用，AGE與RAGE結合后激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶），通過p38MAPK/NF-κB途徑促進腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1、IL-6的分泌，使腸道L細胞出現炎性損傷反應［41］。此外，腸上皮細胞表面表達和分泌的糖基有獨特的功能。腸上皮聚糖在宿主-微生物交互作用中有不可或缺的作用，腸道糖基化在調控微生物的同時也受微生物刺激和腸道免疫系統調節［42］。關于腸道微生物的蛋白質糖基化研究也較多，其大多發生于鞭毛蛋白和黏附素等表層結構中，能調控細菌蛋白的穩定性與活性、宿主的免疫反應，在腸道微生物的生命活動中發揮著重要作用［43］。

研究表明調節腸內多糖水平可以改善IBS腸道動力障礙，IBS患者攝入半乳糖基轉移低聚糖（一類多糖）治療4周后，其糞便黏稠度、胃腸脹氣、復合癥狀評分和主觀整體評估等方面有顯著改善［44］。而在IBS內臟高敏性方面，研究者發現給予小鼠口服含低聚糖、二糖、單糖和多元醇（FODMAP）的飲食可誘導小鼠產生IBS內臟高敏反應，這與結腸肥大細胞數量增加和結腸上皮細胞晚期RAGE表達增加有關［45］。而口服抗糖化劑吡哆胺后能減輕小鼠內臟高敏性癥狀，表明抑制糖基化反應可以減輕FODMAPs引起的IBS內臟高敏反應［45］。在腸道黏膜屏障方面，腸道黏液層主要由分泌細胞（如杯狀細胞）分泌形成，黏蛋白是腸道黏液層的重要組成部分。Da Silva等［46］發現，與空白對照組相比，IBS模型大鼠腸道黏蛋白Muc2表達無明顯差異，而黏蛋白的O-連接糖基化改變明顯，出現含有O-聚糖結構的細長的聚氨基葡糖鏈，影響黏蛋白纖維之間的物理化學作用，與黏液層缺損和功能缺失密切相關。

5 小結和展望

IBS是復雜的胃腸功能紊亂性疾病，其多種臨床癥狀對患者的日常學習、生活、工作和心理等方面造成困擾，給患者生活質量帶來嚴重影響。PTMs與IBS內臟高敏性、腸黏膜屏障等方面關系密切，這為深入研究PTMs在IBS中的作用奠定了基礎，為明確IBS的發病機制、臨床診斷、治療提供了更多的潛在靶點。此外，更多種類的蛋白修飾類型被發現以及蛋白質組學技術的發展將有助于深入研究PTMs與IBS的關系，進而更好地揭示IBS的發病機制，為臨床治療IBS提供新的思路。