高遷移率族蛋白1在心肌缺血再灌注損傷中作用的研究進展

陳川斌，黃鋒

心血管狹窄或閉塞可導致心肌缺血事件發生，嚴重而持久的心肌缺血易發展成不可逆的心肌梗死，及時恢復冠狀動脈血液灌注是挽救瀕死心肌的關鍵，其主要措施有經皮冠狀動脈介入治療、溶栓和冠脈搭橋術［1］。通過再灌注治療，心肌得以恢復氧及營養物質的供應，但同時加重了心肌組織進一步損傷，即心肌缺血再灌注損傷［2］。心肌缺血再灌注損傷涉及多種復雜的病理機制，研究證明其與鈣超載、氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡和自噬等密切相關［2-4］。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1，HMGB1）是一種非組蛋白的染色體結合蛋白，普遍存在于真核細胞的胞核內，在基因復制、轉錄和修復過程中有重要作用［5］。HMGB1的作用在心肌發生缺血再灌注時產生了極大轉變。Andrassy等［6］首次闡述了HMGB1在心肌缺血再灌注損傷中是一種“危險分子”。其在心肌缺血再灌注損傷中的作用較為廣泛且復雜。本文就HMGB1在心肌缺血再灌注損傷中的病理機制進行綜述。

1 HMGB1概述

1.1 HMGB1結構、功能和生物活性HMGB1由215個氨基酸殘基構成，包含2個同源結構域，其中B盒是炎性功能區，A盒具有拮抗B盒作用［7］。根據A盒第23、45位點的半胱氨酸殘基（C23、C45）和B盒第106位點的半胱氨酸殘基（C106）氧化還原修飾不同，HMGB1分為3種類型，包括完全還原型HMGB1（fully reduced HMGB1，fr-HMGB1）、二硫鍵型HMGB1（disulfide HMGB1，ds-HMGB1）和氧化型HMGB1（oxidized HMGB1，ox-HMGB1），其 中fr-HMGB1和ds-HMGB1的生物活性較為廣泛。生理條件下，胞核內fr-HMGB1維持核小體結構、基因轉錄和DNA損傷修復。受刺激因素影響，fr-HMGB1向核外易位，發生氧化形成ds-HMGB1。兩者廣泛參與機體免疫應答、細胞遷移和增殖分化等過程［7-8］。

1.2 HMGB1相關受體和通路

1.2.1 晚期糖基化終末產物受體（RAGE）RAGE是一種多配體跨膜蛋白，包含3個不同片段，其中胞外段V型結構域可識別晚期糖基化終末產物、HMGB1、S100/鈣粒蛋白和β淀粉樣肽等配體，胞內段經絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，激活核轉錄因子-κB（NF-κB）［9］。

1.2.2 Toll樣受體（TLRs）TLRs是一類跨膜受體蛋白，通過識別病原體相關分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）或損傷相關分子 模 式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）激活天然免疫系統［10］。TLRs由胞外段、跨膜段和胞內段構成，其中胞外段重復亮氨酸結構域（LRR）可識別HMGB1配體，胞內段的Toll/白細胞介素-1受體（TIR）結構域經髓樣分化因子88（MyD88）途徑，或β-干擾素TIR結構域銜接蛋白（TRIF）途徑，均可激活NF-κB［11］。

1.2.3 NF-κB信號通路生理條件下，NF-κB抑制蛋白α（IκB-α）與細胞核表面NF-κB結合緊密，有效阻止NF-κB向細胞核內易位。受刺激因素影響，胞外HMGB1與RAGE或TLRs受體結合，促使IκB激酶β（IKK-β）磷酸化修飾IκB-α，導致IκB-α降解，NFκB脫離IκB-α；游離的NF-κB易位至核內編碼炎性基因，誘導細胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-8及HMGB1等多種促炎因子，形成一種正反饋促炎環路［12-13］。

2 HMGB1參與心肌缺血再灌注損傷的病理機制

在心肌缺血再灌注中，HMGB1主要由損傷或壞死心肌細胞被動釋放和（或）浸潤中性粒細胞、單核/巨噬細胞等免疫細胞主動分泌［6］，而較少由內皮細胞或成纖維細胞釋放［14］。研究發現，損傷心肌組織中HMGB1隨缺血時間延長而增加［15］，再灌注7 d后增加仍較為明顯［6］。血循環中HMGB1在心肌缺血40 min仍未見明顯增加，而在再灌注5 min后迅速增加［15］，30 min后增加更為顯著［10］。心肌缺血再灌注后釋放的HMGB1參與包括炎癥反應、細胞凋亡和自噬等機制，從而加重心肌損傷。

2.1 炎癥反應

2.1.1 中性粒細胞HMGB1在缺血再灌注心肌組織中對脾源性中性粒細胞的趨化顯著［16］。再灌注后，釋放入血中的HMGB1和游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）明顯增多，HMGB1可能與脾細胞膜受體RAGE結合，促使cfDNA滲入胞內（具體機制尚不明確），入胞后cfDNA與TLR9結合，釋放促炎信號，誘導脾區的中性粒細胞向受損心肌組織遷移，又進一步促進HMGB1釋放，產生炎癥級聯反應。研究表明，抑制HMGB1或cfDNA釋放入血，均能夠有效減輕心肌缺血再灌注損傷［15］。再者，敲除小鼠脾細胞RAGE基因，也可減弱再灌注后HMGB1誘導的脾源性中性粒細胞趨化作用［16］。

2.1.2 單核/巨噬細胞Fujiwara等［10］推測，相較中性粒細胞，單核/巨噬細胞趨化在心肌缺血再灌注損傷中可能起更為主要的作用，但尚未見報道HMGB1能誘導單核/巨噬細胞趨化。Andrassy等［6］利用外源性HMGB1誘導正常巨噬細胞，可促使細胞分泌IL-6和TNF-α，而這一干預在RAGE基因缺陷的巨噬細胞中無明顯變化。因此，再灌注后釋放的HMGB1可能與單核/巨噬細胞RAGE受體結合，誘導單核/巨噬細胞釋放炎性因子。HMGB1能否與單核/巨噬細胞的TLRs受體結合參與炎癥反應尚未清楚，但Fujiwara等［10］采用納米顆粒技術，通過靶向拮抗小鼠體內的單核/巨噬細胞TLR4受體，可有效抑制心肌缺血再灌注后HMGB1釋放及NF-κB通路激活，減輕心肌組織炎癥損傷。

2.1.3 樹突狀細胞Xue等［17］發現，心肌缺血再灌注后釋放的HMGB1與樹突狀細胞TLR4受體結合，經MyD88途徑，可激活NF-κB通路，促使樹突狀細胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α等諸多炎性因子，還可誘導樹突狀細胞聚集，并遷移至受損心肌組織。相反，拮抗HMGB1活性，顯著減弱了缺血再灌注后樹突狀細胞聚集、趨化和分泌炎性因子的作用。

2.2 細胞凋亡

2.2.1 c-jun氨基末端激酶（JNK）通路Andrassy等［6］利用外源性HMGB1誘導正常心肌細胞，并未有效激活JNK信號通路。之后研究發現，心肌細胞經缺氧/復氧處理后同時釋放HMGB1和TNF-α，TNFα在HMGB1協同作用下，顯著激活JNK信號通路，活化的JNK誘導胞內B淋巴細胞瘤-2蛋白（Bcl-2）相關X蛋白（Bax）易位至線粒體膜，改變膜上Bcl-2與Bax的比例，導致膜間隙釋放細胞色素C，激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspase）級聯反應，最終促使心肌細胞凋亡［18-19］。Zhai等［19］利用甘草甜素預處理小鼠，能夠降低心肌缺血再灌注后HMGB1水平，抑制JNK信號通路的激活。因此，TNF-α/JNK凋亡信號通路可能部分依賴HMGB1調控。

2.2.2 受體相互作用蛋白（RIP）1/RIP3通路研究發現，心肌細胞進行缺氧/復氧后釋放的HMGB1可能激活RIP1，活化的RIP1通過磷酸化修飾RIP3，兩者形成RIP1-RIP3壞死復合體，促使下游混合譜系激酶結構域樣蛋白（MLKL）磷酸化，磷酸化的MLKL破壞了細胞內膜完整性，最終導致心肌細胞壞死性凋亡；隨后，該研究通過沉默心肌細胞HMGB1表達，抑制缺氧/復氧后細胞內RIP1/RIP3/MLKL信號通路活化，細胞壞死性凋亡亦被抑制［20］。

2.2.3 其他研究發現，敲除心肌細胞膜受體TLR4基因，可抑制心肌缺血再灌注后HMGB1/TNF-α凋亡通路的激活［18］。此外，Herzog等［14］分別沉默心肌細胞中不同的膜受體TLR2、TLR4和RAGE表達，對比三者發現，沉默TLR2表達能夠更顯著地下調缺氧/復氧后心肌細胞中HMGB1介導的凋亡通路的激活。由此可見，HMGB1與缺氧/復氧的心肌細胞TLRs或RAGE受體結合或許存在部分相同凋亡信號通路，抑制HMGB1/TLR2通路激活可能發揮更廣泛的抗凋亡作用。

2.3 自噬

2.3.1 胞核內研究顯示，心肌細胞胞核內HMGB1可能通過激活轉錄因子調節功能，正向調控熱休克蛋白B1（HSPB1）表達（具體機制尚未明確），兩者均參與了Pink1/Parkin途徑線粒體自噬過程。激活HMGB1/HSPB1信號通路不僅促進Parkin易位至線粒體外膜，上調電壓依賴性陰離子通道蛋白1（VDAC1）泛素化水平，有利于自噬小體識別受損線粒體，還可促進自噬小體與溶酶體融合，維持自噬動態過程［21］。Yang等［22］對HACMs心肌細胞進行缺氧/復氧處理后，發現HMGB1/HSPB1信號通路明顯受抑制。隨后，該研究將pcDNA-HMGB1轉染至心肌細胞內，通過過表達HMGB1上調HSPB1蛋白水平，激活缺氧/復氧的心肌細胞中HMGB1/HSPB1通路，可促進線粒體自噬過程，加速清除受損線粒體，改善ATP供給短缺。

2.3.2 胞核外生理條件下，分布在心肌細胞胞核外的HMGB1較少，受刺激因素影響，胞核內HMGB1可遷移到胞質及胞外。胞質中HMGB1通過直接競爭性分離Bcl-2/Beclin-1復合體，或者通過激活細胞外調節蛋白激酶1/2（ERK1/2）信號通路，誘導Bcl-2磷酸化，間接促使Bcl-2和Beclin-1分離，游離的Beclin-1與HMGB1結合促進自噬小體形成［6，21］。胞外的HMGB1通過與RAGE受體結合，抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路激活，促使Beclin1/Ptdlns3KC3復合體增多，從而誘發自噬［21］。Hu等［23］發現，心肌細胞進行缺氧/復氧后胞內的Bcl-2表達降低，而Beclin-1表達升高，伴隨微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）變化，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升和p62蛋白降解，自噬活性明顯增強，這可能與細胞缺氧/復氧后釋放的HMGB1有關。隨后，該研究發現，使用HMGB1抗體預處理心肌細胞，減少細胞缺氧/復氧后釋放的HMGB1，可抑制Beclin-1途徑自噬激活。Su等［24］在心肌細胞中沉默HMGB1表達，也可降低經H2O2處理后的細胞內Beclin-1途徑自噬水平，緩解細胞損傷。

2.4 內質網應激（ERS）有研究顯示，HMGB1可能參與激活心肌缺血再灌注后ERS。該研究通過沉默大鼠心肌組織HMGB1表達，發現大鼠心肌缺血再灌注后幾種ERS標志蛋白如糖調節蛋白78（GRP78）、增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）和caspase-12均受抑制［25］，但相關的信號通路尚未闡明。

3 心肌缺血再灌注損傷中HMGB1與其他小分子間的調控作用

3.1 非編碼RNA

3.1.1 微小RNA（miRNA）近年研究證實，心肌缺血再灌注損傷中存在多個保護性miRNA靶向作用于HMGB1。Chen等［26］在體外研究中將miR-129-5p激動劑注入缺氧/復氧的心肌細胞中，發現表達增多的miR-129-5p可抑制HMGB1表達，進而改善Bcl-2/Bax比例失衡，起到抗細胞凋亡作用；并且，在體內研究進一步驗證miR-129-5p通過靶向抑制HMGB1發揮心肌保護作用。Su等［24］將miR-142-3p模擬物轉染至心肌細胞后，發現表達增多的miR-142-3p可靶向抑制HMGB1，顯著減少經H2O2處理的心肌細胞發生的細胞凋亡和自噬，從而有效挽救受損心肌細胞［24］。Li等［27］發現，丙泊酚能顯著上調心肌缺血再灌注大鼠模型中miR-451的表達水平，表達增多的miR-451可通過靶向抑制HMGB1，產生抗細胞凋亡作用。Liu等［28］發現，過表達miR-25可通過靶向抑制HMGB1，有效地減少缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡的發生。Yao等［29］在給予慢病毒搭載pre-miR-26a轉染小鼠預處理中發現，小鼠心臟供體有助于減輕心臟移植術后發生的心肌缺血再灌注損傷，其機制可能與miR-26a靶向抑制HMGB1有關。

3.1.2 長鏈非編碼RNA（lncRNA）Shi等［30］發現，心肌細胞缺氧缺糖/復氧后，lncRNA?；撬嵘险{基因1（taurine upregulated gene-1，TUG1）表達上調，細胞凋亡水平增高，這可能與TUG1激活HMGB1有關。隨后，進一步對心肌細胞TUG1沉默處理，結果顯示抑制TUG1能夠減少缺氧缺糖/復氧后HMGB1釋放，改善線粒體膜上Bcl-2/Bax比例失衡，發揮抗細 胞 凋亡 作 用。Su等［24］發現，lncRNA TUG1為miR142-3p的“分子海綿”，心肌細胞進行H2O2處理后，TUG1減弱了miR142-3p對靶基因HMGB1的抑制作用，使HMGB1活性增強；相反，沉默心肌細胞內TUG1，再灌注后miR142-3p的表達增高，miR142-3p則通過靶向抑制HMGB1，減少心肌細胞凋亡和自噬。

3.2 蛋白和信號通路

3.2.1 拮抗蛋白Herzog等［14］對心肌細胞進行缺氧/復氧實驗后發現，血栓調節蛋白（TM）的凝集素樣結構域（LLD）能夠競爭性結合HMGB1，在心肌細胞中轉染含LLD的TM cDNA質粒，上調TM表達，能顯著抑制再灌注后HMGB1/TLR2凋亡信號通路的激活。Ma等［31］利用二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑干預缺氧處理的H9C2心肌細胞，發現核因子E2相關因子（Nrf2）和血紅素加氧酶1（HO-1）表達增高，而HMGB1表達降低。Ma等［32］在對大鼠行心肌缺血再灌注術前注射IL-33，發現IL-33可能通過與生長刺激表達基因2蛋白（ST2）結合，激活p38信號通路，抑制缺血再灌注后HMGB1和炎癥因子的釋放，從而發揮心肌保護作用。

3.2.2 膽堿能抗炎通路研究顯示，激活迷走神經抗炎通路可抑制心肌缺血再灌注后HMGB1釋放。右美托咪定預處理可通過興奮迷走神經，促使乙酰膽堿（Ach）釋放，結合N樣受體（nAchR），尤其與α7nAchR結合，有效地抑制了缺血再灌注后釋放的HMGB1與TLR4受體結合，從而下調經MyD88依賴途徑所激活的NF-κB通路，減少IL-6和TNF-α釋放［33-34］；反之，以阻斷迷走神經興奮或者拮抗Ach與α7nAchR結合的形式抑制膽堿能抗炎通路，均可導致再灌注后HMGB1釋放增加，激活HMGB1/TLR4信號通路［33］。

3.2.3 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路PI3K/Akt信號通路在心肌缺血再灌注損傷中可發揮保護效應。研究表明，雷公藤紅素預處理可通過激活PI3K/Akt信號通路，有效地減少心肌缺血再灌注后HMGB1釋放，從而抑制Beclin-1自噬相關信號通路激活；相反，LY294002（PI3K抑制劑）阻遏了雷公藤紅素的保護作用，導致再灌注后HMGB1釋放增加［35］。另一項研究顯示，丹酚酸B預處理也可通過激活PI3K/Akt信號通路，抑制HMGB1/TLR4途徑的活化，有效地減少炎性因子釋放及細胞凋亡發生，而LY294002預處理也同樣減弱了丹酚酸B的保護作用［36］。

4 外源性HMGB1

4.1 預處理研究發現，在大鼠心肌缺血再灌注術前30 min予小劑量HMGB1（12.5～60 ng/只）處理，可減輕再灌注后心肌損傷，呈劑量依賴性增益效果［37］。這其中可能參與的信號通路包括激活PI3K/Akt信號通路和（或）抑制p38/MAPK信號通路，從而上調低氧誘導因子-1α（HIF-1α）表達，已證明HIF-1α對心肌缺血再灌注損傷有多種保護效應，包括改善能量代謝、抗細胞凋亡和抗氧化應激作用［38］；激活PI3K/Akt信號通路能通過上調血管內皮生長因子（VEGF）表達，減輕缺血再灌注后心肌間質纖維化，從而改善心功能［39］。術前24 h予大劑量HMGB1（50～60μg/只）處理，同樣可激活PI3K/Akt信號通路，減輕再灌注后炎癥損傷和氧化應激［40］。由此可見，外源性HMGB1并非單純作為內源化補充，導致心肌缺血再灌注損傷。上述研究表明，時間和劑量可能是改善再灌注心肌損傷結局的關鍵因素。在可控的時間和劑量下，外源性HMGB1預處理不足以引起正常機體損傷，但其可被視為“危險信號”，使機體產生“警覺”，激活非特異免疫反應，產生一些“正在路上”的保護性因子，為心臟提供適應性和保護性應答。

4.2 后處理Abarbanell等［41］研究顯示，在大鼠離體心臟的冠脈內注射HMGB1（200 ng）進行后處理能夠減小再灌注后心肌梗死面積，有效改善心功能，但加大HMGB1劑量（1 000 ng）后處理減弱了上述作用。Lin等［42］在大鼠心肌缺血再灌注模型予中、小劑量HMGB1（0.22～2.5μg/只）后處理，發現心肌再灌注后心肌梗死面積和心功能無明顯變化；同時，模型中注射大劑量HMGB1（22～25μg/只）進行后處理，心肌再灌注后引起炎癥因子釋放增多，最終導致損傷加重；然而，體內研究中，HMGB1后處理并未有效改善心肌損傷，這其中機制尚未清楚，推測與機體缺血事件發生后抑制了保護性信號通路激活或保護性因子釋放有關，最終導致后處理時這些保護性因素無法有效應答外源性HMGB1的刺激信號；離體研究中，小劑量外源性HMGB1后處理可使再灌注后心肌損傷獲益；與體內研究不同，離體切斷了全身血液循環，這一局部干預對受損心肌組織的作用機制仍未闡明。

5 小結與展望

在心肌缺血再灌注損傷中，內源性HMGB1介導的炎性因子對心肌細胞造成炎癥損傷，并且參與細胞凋亡和自噬調控心肌細胞的死亡進程。上述病理機制又增加HMGB1釋放，形成惡性循環。通過拮抗內源性HMGB1可有效遏制各個病理過程。而外源性HMGB1除了作為內源性補充，還可能對心肌再灌注損傷起保護作用，選擇合適的時間與劑量給予外源性HMGB1，可有效改善心肌再灌注損傷。干預HMGB1作用的制劑也很重要，HMGB1 A盒、單克隆抗HMGB1抗體等生物制劑尚未得到臨床推廣，藥物研究顯示雷公藤紅素、丹酚酸B等具備抑制HMGB1作用。因此，應不斷深入了解心肌缺血再灌注損傷中HMGB1所產生的作用，盡可能使干預HMGB1靶點發揮最大化效益。