超聲靶向微泡破壞技術在心肌梗死基因治療中的應用

鄒云雷，劉小慧，胡兵，劉朝奇，趙云

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是在冠狀動脈病變的基礎上，發生冠狀動脈供血急劇減少或中斷，使相應的心肌因嚴重而持久的急性缺血而壞死［1］。AMI后，盡早再灌注治療可減少急性心肌缺血/再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷、挽救存活心肌和限制心肌梗死范圍。近年來，隨著治療方法的改進及治療水平的提高，AMI患者的短期存活率得以提高，但繼發的并發癥（如心律失常、心力衰竭和心源性休克等）仍是患者死亡的重要原因，AMI后心源性休克患者的病死率高達40%以上［2］。因此，如何有效控制AMI并發癥、提高AMI的治愈率備受關注。近年來，隨著人們對心肌梗死分子機制了解的深入，就基因治療心肌梗死進行了大量的實驗研究，心肌梗死的基因治療手段逐漸豐富。然而，由于缺乏安全有效的靶向遞送系統，轉染基因難以持續表達，基因治療的臨床應用受到限制。超聲靶向微泡破壞（ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）技術作為一種新興的藥物遞送方式，具有侵襲性小、特異性強、轉染效率高等優勢，已經被成功地應用于臨床試驗中［3］。本文對UTMD在心肌梗死基因治療中的應用研究進展綜述如下。

1 UTMD介導基因遞送

1.1 UTMD技術應用的微泡載體特點UTMD技術使用的微泡，包括全氟丙烷脂質微泡、人血白蛋白八氟化丙烷微泡和六氟化硫微泡，與超聲成像中常用的對比劑在結構和聲學特性方面有諸多相似之處［4］。其氣泡殼可以由脂類、白蛋白、糖類或生物相容性聚合物組成。殼材料可添加帶電的脂質來改變殼層電荷，從而產生陽離子微泡，使核酸能夠與微泡電荷耦合。微泡內由氣體填充，第一代微泡常填充空氣或氮氣，第二代微泡主要填充全氟化碳或六氟化硫等高分子惰性氣體。由于第二代微泡惰性氣體在血液中的溶解度較低，微泡的穩定性更好，從而延長了微泡在血液循環中的持續時間。微泡直徑通常在0.5～10μm，小于或接近正常紅細胞的直徑（6～9 μm），因此其注入靜脈后能夠順利地通過肺循環。超聲微泡成像已經廣泛應用于心臟、甲狀腺、肝臟等臟器的臨床診療中，其安全性好，無肝腎毒性，僅有輕微和短暫的不良反應。微泡載體遞送基因使用了3種策略：（1）微泡與基因共給藥（分離/不偶聯）；（2）電荷作用將基因耦合到微泡表面；（3）基因或偶聯蛋白與微泡殼或管腔結合。第1種策略的基因需與其他保護性載體，如質粒、帶正電的脂質體、多聚復合物等相結合。此種方式較簡單且易于轉化應用于臨床，但超聲束照射范圍以外的組織也可同時發生非特異性轉染。此外，由于聲穿孔效應的短暫性，要輸送的藥物必須位于超聲微泡附近，因此轉染的效率和靶向性較后兩種策略差。而第2、3種策略是將微泡直接作為載體，其顯著優勢是，當載基因的微泡輸送至靶細胞表面時，短暫的聲穿孔效應為基因的細胞內轉染提供了有限的時間，提高了轉染效率。第2種策略是基因通過靜電吸附耦合至陽離子脂質微泡表面，此種微泡容易制備，但微泡的負載能力受限于其表面積，因此必須注入大量的微泡才能達到預期的效果。第3種策略是將質粒DNA摻入可生物降解的聚合物微泡的氣體核中，這種方法不僅可以保護質粒免受宿主核酸酶的降解，而且可以使每個微泡獲得較高的質粒負載。這種聚合物微泡的優點是可以同時引入疏水性和親水性藥物，但其制備工藝較為復雜，影響包封率的工藝因素較多，例如分散技術、聚合物的組成、溫度、離子強度等［5］。

1.2 UTMD技術介導基因轉染的機制UTMD技術介導基因轉染主要是通過靜脈注射或靜脈滴注的方式，將微泡核酸復合物遞送至心臟或靶血管床，然后利用間歇性高功率超聲輻照破壞微泡，在特定部位釋放高濃度基因。UTMD技術通過聲孔、局部剪切力、局部沖擊波、空化微射流和內吞作用等機制，提高了基因在局部的轉染效率。有研究表明，在超聲束照射范圍以外很少發生基因轉染，顯示了UTMD的靶向性和安全性［6］。UTMD技術介導基因遞送的主要機制有：（1）微泡可增強超聲空化效應。（2）微泡在特定部位被擊破后釋放基因，可提高靶器官或病灶局部的基因濃度。（3）將核酸與微泡結合，可防止核酸被內源性脫氧核糖核酸酶降解，延長其循環半衰期。

1.3 UTMD技術轉染優化超聲參數包括超聲功率、脈沖或觸發間隔、超聲頻率、輻照時間等。機械指數（mechanical index，MI）是聲功率的一種替代測量方法，MI越高通常提示UTMD技術轉染效率越高，但過高的MI也會導致靶組織內微血管漏、溶血性毛細血管破裂、出血等不良反應的發生。與連續超聲相比，觸發超聲的轉染效率更高，主要是因為觸發超聲允許微泡基因復合物在脈沖之間有更多的時間進入微血管。有關脈沖間隔時間對轉染影響的研究尚少見。Fujii等［6］在大鼠異位乳腺癌模型中，利用UTMD技術介導血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）短發夾RNA（shRNA）質粒轉染，評估脈沖間隔時間分別為2、5、10、20 s時VEGFR2基因敲除和腫瘤血管生成抑制作用的差異，結果顯示，脈沖間隔時間為10 s時，VEGFR2基因敲除效率和腫瘤血管生成抑制作用最優；當脈沖間隔時間為10 s時，腫瘤組織剛好完全被微泡填充。一般認為超聲波頻率越低，UTMD技術的轉染效率越高。在對比劑充足的情況下，延長輻照時間可以破壞更多對比劑，在相同的輻照時間下，間隔多次輻照的遞送效果優于單次輻照。

為了優化UTMD技術的轉染效果，還需要考慮非超聲參數，如DNA用量、微泡因素、靶組織類型、注射方式等。一般認為，微泡的粒徑越小，微泡膨脹率就越大，UTMD技術介導的基因遞送效果也就越好。與靜脈注射相比，動脈注射時血管周圍的轉染率更高。

2 心肌梗死的基因治療

2.1 治療心肌梗死的潛在靶基因

2.1.1 血管新生基因重新血管化被認為是減輕心室不良重塑和改善心臟功能的有效方法。多種途徑和分子參與了血管生成的啟動和調節，如堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子（HGF）、血小板生長因子（PDGF）等可進入梗死區促進血管生成［7］。VEGF是一種對內皮細胞特異的有絲分裂原，參與血管生成的誘導，通過酪氨酸激酶受體途徑促進內皮細胞分化和遷移。Thirunavukkarasu等［8］研究顯示，被誘導心肌梗死后的糖尿病小鼠給予VEGF和血管生成素（Ang）-1聯合干預后，其新生血管明顯增多。HGF在早期心臟發育中起關鍵作用，可誘導有絲分裂、抑制細胞凋亡、促進血管生成及減少心肌纖維化。HGF基因修飾的間充質干細胞（MSCs）可促進心肌血管的新生和恢復。此外，HGF可減輕心肌梗死模型的炎癥反應，其可能通過調節炎癥細胞因子發揮心肌梗死的治療作用，但HGF對促炎細胞因子的調節機制尚不明確。有研究表明，人肝細胞生長因子重組腺病毒（Ad-HGF）可降低心肌梗死大鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β和IL-6的基因和蛋白表達水平，提示HGF改善左室重構可能是通過下調促炎細胞因子來實現的［9］。

2.1.2 抗梗死區纖維化基因心肌梗死后會發生心肌纖維化，其特征是梗死區細胞外基質（ECM）過度沉積，導致組織硬化，限制心臟的收縮和舒張功能。雖然最初形成的纖維化組織具有防止心臟破裂的作用，但持續的心肌纖維化將導致心功能下降。轉化生長因子（TGF）-β與心肌成纖維細胞中的TGF-β受體（TGF-βRS）結合形成的肌成纖維細胞是導致心肌纖維化的原因。因此，為了防止心肌纖維化的進展，抑制肌成纖維細胞的形成至關重要。目前主要采用TGF-β抑制劑或抗TGF-β抗體全身給藥的方法，以減少心臟中活性TGF-β的數量，進而抑制肌成纖維細胞的形成。bFGF是通過增加梗死區心臟血管的生成間接發揮抗纖維化作用。近期有研究證實，bFGF亦能夠抑制由TGF-β誘導的心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，直接發揮抗纖維化作用［7］。

2.1.3 增加心肌收縮力的基因基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）是一種鋅依賴性蛋白酶，在心肌I/R損傷時被激活，導致心肌收縮功能障礙。MMP-2定位于心肌細胞內的幾個亞細胞部位，但其在肌漿網（SR）中的作用尚不清楚。Ca2+ATP酶SERCA2a可將胞漿Ca2+泵入SR，促進肌肉松弛，但該酶在I/R中被降解。MMP抑制劑ARP-100在I/R時可阻止70 ku-SERCA片段形成，該片段在再灌注結束時與心肌收縮功能呈負相關［10］。

2.1.4 再生心肌梗死后心臟的再生一直是研究者努力的方向。越來越多的臨床前研究表明，各種類型的干細胞移植，如骨髓源性單核細胞（BMMNCs）、MSCs、循環祖細胞（CPCs）、胚胎干細胞（ESCs）、誘導多能干細胞（iPSCs）等及其衍生物，可改善AMI后心功能［11］。然而，由于移植細胞在缺血心臟的植入和存活不佳，干細胞移植在改善心肌收縮功能和瘢痕減少方面的研究進展十分有限。粒細胞集落刺激因子（G-CSF）可以動員骨髓中的多潛能祖細胞進入外周血，減少心肌梗死面積，改善梗死后的左心室重塑。目前，G-CSF保護心臟的機制是將骨髓祖細胞亞群轉分化為心肌細胞、血管內皮細胞、血管α-平滑肌肌動蛋白和肌成纖維細胞，加速愈合過程以及預防心肌細胞凋亡。在大量G-CSF治療AMI的動物實驗基礎上，研究者進行了多項臨床試驗，結果存在很大差異，這可能與G-CSF的劑量、給藥時間、持續時間和研究對象選擇差異有關［12］。

2.2 RNA干擾（RNAi）策略在心肌梗死治療中的應用近年來，基因沉默成為心血管疾病基因治療的熱點。小干擾RNA（siRNA）是長21～23 nt的雙螺旋RNA序列，能高效、特異地靶向mRNA的序列，用于下調疾病相關基因、蛋白或受體的表達。通過RNAi下調TGF-β、Src同源區2、晚期糖基化終產物受體（RAGE）和CD47等多種炎性因子可治療I/R損傷［13］。Zhang等［14］研究發現，利用X非活性特異性轉錄本（XIST）siRNA對長鏈非編碼RNA（lncRNA）XIST基因進行敲除，可通過下調miR-449的表達，抑制AMI模型大鼠心肌細胞凋亡，減輕心肌病理損傷，從而增強心功能。

同樣，微小RNA（miRNA）從Watson-Crick模型到基因沉默載體的研究取得了進展。與siRNAs相似，miRNAs在改變基因功能方面也發揮著重要作用。miRNA由長約22 nt的雙鏈RNA片段組成，其通過與mRNA上的堿基互補序列結合，抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解，調節基因表達。大量研究表明，miRNAs參與了AMI的發病過程，miRNAs的變化包括miR-15b、miR-21、miR-199、miR-214表達上調和miR-29c、miR-150表達下調。AMI后，由于心肌成纖維細胞中miR-29表達下調，一些纖維化基因的表達增加，而miR-29的過度表達能夠降低這些纖維化基因的表達，提示miRNA可以作為抑制AMI后心肌纖維化的治療靶點［15］。

3 UTMD技術在心肌梗死基因治療中的應用

3.1 提高UTMD技術介導基因轉染效率的方法靜脈注射脂質微泡已被證明在臨床評價心肌灌注和臨床前心臟基因遞送方面是成熟的。Cao等［16］將冠狀動脈基因灌注聯合UTMD技術應用于心肌梗死的治療，結果表明，冠狀動脈注射較靜脈注射可提高Ang-1質粒的轉染效率，上調外源性血管生成基因的表達，促進血管生成，改善心室重塑。此外，核定位信號（NLS）是一種來源于真核蛋白和病毒蛋白的功能性多肽，可以有效地介導分子的核內轉運。Cui等［17］以UTMD技術和NLS的生物學功能為基礎構建了一個基因傳遞系統，結果表明，Ang-1基因在犬缺血心肌中的轉染效率約為單純UTMD技術系統的1.6倍，提示NLS通過抑制細胞質中轉移基因的降解，有助于外源DNA片段的穩定。

3.2 UTMD技術介導基因沉默基因抑制療法以干預基因轉錄和翻譯為目的，越來越受到研究者的重視。在大鼠實驗中，shRNA通過UTMD技術介導針對脯氨酰羥化酶2（PHD2）、G-CSF、S100A6、MMP-2、穿膜肽（TATp）、外周血干細胞因子（SCF）和基質細胞衍生因子（SDF）-1α的局部傳遞，可有效減少心肌梗死面積、改善心肌重塑和血管重構［18-20］。研究發現，UTMD技術介導的shPHD2轉染成功地實現了PHD2基因的敲除，通過上調缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、VEGF和bFGF的表達，對心肌細胞H9C2產生HIF-1α依賴性的保護作用；該研究將UTMD技術介導的shPHD2基因轉染至大鼠缺血模型的局部缺血心肌中，可沉默PHD2，通過上調其下游基因，從而發揮減少心肌梗死面積和改善心功能的作用［18］。

3.3 UTMD技術用于增加基因表達的治療超聲微泡可作為小鼠體內VEGF、SCF、生長分化因子（GDF）11，兔體內CD151和Ang-1，豬體內miR-21和犬體內HGF的有效載體［21-24］。Su等［25］將攜帶SDF-1α基因的腺病毒加載到微泡載體上，利用UTMD技術將腺病毒釋放到AMI大鼠體內，通過檢測骨髓間充質干細胞（BMSCs）從外周血歸巢至梗死心肌的數量，探討SDF-1α在梗死心肌中過度表達誘導BMSCs自體移植的可能性，結果顯示轉染后外周血SDF-1α水平明顯升高，外周血和梗死區BMSCs數量明顯增多，提示隨著SDF-1α表達水平的升高，歸巢BMSCs數量增加。因此，外源性SDF-1α基因通過UTMD技術介導對AMI大鼠心肌細胞的遞送，能有效促進內源性BMSCs向心臟歸巢，歸巢干細胞的數量受SDF-1α表達水平的控制。Shentu等［26］將抗P-選擇素單克隆抗體與脂質殼結合，制備了靶向P-選擇素的pcDNA3.1-人血管內皮生長因子165（pCDNA3.1-hVEGF165）磷脂微泡，通過UTMD技術技術的支持，利用靶向超聲對比劑對缺血心肌進行鑒定，釋放pCDNA3.1-hVEGF165重組質粒，證實UTMD技術介導VEGF的釋放可增加心肌血管密度，改善心功能。

3.4 UTMD技術在心肌I/R損傷中的應用I/R是心力衰竭的主要危險因素之一，而內源性干細胞的再生能力在損傷后的組織修復中起著重要作用。在衰老的個體中，干細胞的再生能力降低，組織缺乏更新能力。經UTMD技術多次應用腫瘤壞死因子受體相關因子3交聯蛋白（2TRAF3IP2）、GDF11、VEGF-a、胰島素樣生長因子（IGF）-1、Cav-3、骨髓細胞、MMP-2、Akt1均能恢復老年心臟功能，保護其免受I/R損傷［20，27-29］。有研究表明，采用UTMD技術介導的GDF11質粒在I/R后向老年老鼠心臟的傳遞，有效且選擇性地增加了GDF11在心臟中的表達，改善了心功能，縮小了梗死面積，在老年老鼠心臟細胞中，GDF11的過度表達降低了衰老標志物p16和p53的表達；此外，GDF11過度表達后，心臟干細胞抗原1（Sca-1+）增殖增加，老年缺血性心臟出現內皮祖細胞歸巢增加和血管生成，經UTMD技術重復靶向傳遞GDF11基因，可使衰老小鼠心臟恢復活力，保護其免受I/R損傷［21］。Chen等［30］研究發現，經UTMD技術延遲向缺血心肌輸送骨髓細胞（BMC），可顯著減輕I/R后的心臟重塑，類似于甚至優于早期BMC治療，UTMD技術聯合延遲BMC治療后，組織病理學顯示毛細血管密度增大，心肌細胞、c-kit+細胞增殖增加；此外，超聲靶向的微泡空化和外源性BMCs的旁分泌作用，可促進血管生成并誘導VEGF分泌。因此，新血管形成、心肌細胞和c-kit+細胞增殖可能是UTMD技術聯合延遲BMC治療減輕心肌梗死后心臟重塑的機制。

4 小結

利用UTMD技術介導基因控釋有望成為心肌梗死基因治療的一種非侵入性技術，在心肌梗死基因治療領域具有潛在的優勢和應用前景。但其在臨床應用前尚存諸多問題亟待解決：（1）需要優化微泡制備方法，保持微泡聲學特性，延長其循環時間。（2）提高微泡攜帶基因的有效載荷，防止基因被單核細胞清除，增強其區域內的組織結合力。（3）改進靶向技術，減少靶向超聲爆破時引起的微血管漏、心內溶血性毛細血管破裂、出血、炎癥細胞浸潤、心肌細胞損傷等不良反應的發生。