福建省龍巖市411例肺結核患者對利福平和異煙肼耐藥狀況的研究

張滿娥 黃文濱 盧志華 張洪彬

世界衛生組織(WHO) 2018年發布的全球結核病報告指出，2017年全球有55.8萬例利福平耐藥結核病(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)和46萬例耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)患者，占新發結核病患者的3.5%和既往經過治療的結核病患者的18%[1]。臨床上以異煙肼(INH)、利福平(RFP)、吡嗪酰胺(PZA)、鹽酸乙胺丁醇(EMB) 等為主導藥品的短程化療間歇療法，已成為世界多數國家認可的治療MDR/RR-TB的常規方案[2]。MTB-DNA陣列芯片法是采用基因芯片技術檢測結核耐藥基因ropB/katG/inhA的基因突變，可快速、早期、準確評估到利福平和異煙肼的耐藥性，及時診斷MDR/RR-TB，可作為MDR/RR-TB早期篩查的方法[3]。為進一步了解福建省龍巖市肺結核患者的耐藥基因檢測情況，福建省龍巖市第二醫院分析了411份行基因芯片技術檢測耐藥基因的臨床標本，旨為本地結核病患者提供抗結核方案制定和藥物選擇的依據。

對象和方法

一、研究對象

收集2016年5月12日至2019年8月17日福建省龍巖市第二醫院門診及收住入院并確診為肺結核的411例患者，其中初治患者312例，復治患者99例；男337例(82.0%)，女74例(18.0%)；年齡14～93歲，中位年齡54(41,65)歲。對初復治患者的411株結核分枝桿菌臨床分離株采用基因芯片技術進行利福平與異煙肼耐藥性及其相關耐藥基因突變位點的檢測。

二、 檢測方法

(一) 儀器和試劑

HEMA 9600聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀由珠海黑馬醫學儀器有限公司生產；結核分枝桿菌耐藥基因檢測芯片試劑盒、芯片雜交儀和微陣列芯片掃描讀片儀均由北京博奧生物技術有限公司生產。

(二) 基因芯片技術

采用基因芯片技術檢測利福平和異煙肼耐藥基因。利福平耐藥相關基因ropB的野生型及不同突變位點分析共檢測6個突變位點，分別為511(T→C)、513(C→A)、516(G→T，A→T，A→G)、526(C→T，C→G，A→T，A→G)、531(C→T，C→G)、533(T→C)位點；異煙肼耐藥相關基因katG和inhA的野生型及不同突變位點分析，分別為katG基因啟動子315(G→C，G→A)位點和inhA基因啟動子-15(G→T)位點。

1.標本處理：在不同類型的送檢標本中，加入不同添加量的10%NaOH，置于室溫30 min或更多時間，直至標本完全液化。

2.核酸提取：取1 ml液化的標本于1.5 ml離心管中，以12 000×g離心5 min，棄上清后加入1 ml生理鹽水，振蕩混勻；再以12 000×g離心5 min，棄上清后在離心管中加入50 μl核酸提取液，振蕩混勻，將混勻后的溶液轉移至核酸提取管中，放入核酸快速提取儀中，以最大轉速振蕩10 min，置于95 ℃金屬浴5 min，以10 000×g離心1 min，備用。

3.PCR擴增：3個200 μl PCR管(標號1、2、3)中分別加入18 μl擴增試劑，再分別加入2 μl樣本核酸，混勻，瞬時以2500×g離心數秒。擴增條件：37 ℃ 10 min；94 ℃變性10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，45個循環；94 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，20個循環；72 ℃延伸7 min。將PCR產物95 ℃變性5 min后立即冰水浴3 min。

4.雜交反應：另取2個200 μl PCR管分別加入9 μl雜交緩沖液，其中1管加入PCR產物1和PCR產物2各3 μl用于利福平耐藥檢測，另1管加入PCR產物1和PCR產物3各3 μl用于異煙肼耐藥檢測。2個管均分別混勻，各取14 μl雜交混合物經加樣孔加入芯片點陣中(微陣列1和3點陣用于檢測利福平耐藥，微陣列2和4點陣用于檢測異煙肼耐藥)，置50 ℃預熱好的雜交儀中雜交2 h。

5.洗片與芯片掃描：按說明書配制洗液Ⅰ和洗液Ⅱ，按已設置的洗滌程序洗片，甩干，然后將芯片插入芯片掃描儀中，運行結核分枝桿菌耐藥檢測芯片判讀系統，軟件自動分析芯片圖像及給出判讀結果。結核分枝桿菌耐藥基因檢測芯片試劑盒判讀結果為：雙敏(均為野生型)、單耐利福平、單耐異煙肼、雙耐(利福平和異煙肼均有位點突變)。

三、統計學處理

采用Excel 2003和SPSS 20.0統計學軟件對數據進行整理、統計和分析。兩組患者分類計數資料采用“率，%”進行描述，計數資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、411例肺結核患者對利福平和異煙肼的耐藥情況

411例肺結核患者中，利福平和異煙肼任一位點突變率為20.2%，其中利福平、異煙肼、利福平和異煙肼同時耐藥(簡稱“耐兩藥”)的耐藥率分別為5.4%、4.6%、10.2%。初治任一位點突變率(9.3%)明顯低于復治任一位點突變率(54.5%)，差異有統計學意義(χ2=95.483，P<0.05)；初治耐兩藥率(2.9%)明顯低于復治耐兩藥率(33.3%)，差異有統計學意義(χ2=75.944，P<0.05)。見表1。

二、不同性別、年齡組患者對利福平和異煙肼的耐藥情況

411例肺結核患者中，不同性別患者的耐藥率差異無統計學意義(P>0.05)；年齡組分布顯示，不同年齡組耐藥率由低到高依次為0～歲組、20～歲組、≥60歲組、40～歲組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 411例初復治肺結核患者的耐藥情況

注耐兩藥指對利福平和異煙肼同時耐藥

表2 411例不同性別、年齡肺結核患者的耐藥情況

注耐兩藥指對利福平和異煙肼同時耐藥

三、結核分枝桿菌對利福平耐藥的相關基因ropB突變位點分析

耐藥基因技術檢測顯示，對利福平耐藥的ropB基因發生突變者22例，其中20例為單一位點突變，僅2例為雙位點突變。突變頻率最高的是531(C→T)，突變頻率為40.9%；其次是516(G→T)、526(C→T)、526(A→T)和531(C→G)，突變頻率均為9.1%。見表3。

表3 22例利福平相關耐藥基因ropB突變位點分布

四、結核分枝桿菌對異煙肼耐藥的相關基因katG和inhA的突變位點分析

耐藥基因技術檢測顯示，對異煙肼耐藥的katG基因和inhA基因共計有19例發生突變，其中13例為katG基因突變，突變率為68.4%；6例為inhA基因突變，突變率為31.6%。突變頻率最高的是315(G→C)，突變頻率為63.2%；其次是-15(G→T)，突變頻率為31.6%。見表4。

表4 19例異煙肼相關耐藥基因katG和inhA突變位點分布

五、結核分枝桿菌同時對利福平和異煙肼耐藥的相關基因突變位點分析

耐藥基因技術檢測顯示，同時對利福平和異煙肼耐藥的基因突變共計42例，其中40例為雙位點突變、1例為三位點突變、1例為四位點突變。突變頻率最高的是531(C→T)315(G→C)，突變頻率為47.6%。見表5。

表5 42例同時耐利福平和異煙肼的基因突變位點分布

討 論

福建省龍巖市下轄一市二區四縣，其結核病專科醫療聯合體是以我院為牽頭單位，聯合各縣(市、區)醫院組建而成。既往對龍巖市肺結核耐藥基因的研究報道較少[4-5]，特別是對一線抗結核藥物利福平和異煙肼相關耐藥基因未見報道。作為龍巖市結核病重點定點醫院，各縣(市、區)醫院將轄區內結核病急危重癥和并發疑難復雜疾病的特殊人群(包括孕產婦、兒童、HIV感染者等)的活動性肺結核，以及需手術治療的肺結核(包括規范抗結核藥物治療后仍有咳嗽、咳痰、咯血等癥狀或病灶局限的肺結核空洞、支氣管擴張、毀損肺、結核性肺不張等)、耐藥肺結核患者均轉診至我院，導致我院肺結核患者相對集中，也成為我院積極、早期采用基因芯片技術進行結核分枝桿菌臨床分離株對利福平與異煙肼耐藥性及其相關耐藥基因突變位點檢測的重要原因。基因芯片技術用于結核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥性及其相關耐藥基因(rpoB/katG/inhA)的基因突變檢測，方法簡便、快速，可以針對臨床標本直接檢測。但也存在菌量濃度要求在1×103CFU/ml及以上的檢出限，以及不能檢出結核分枝桿菌全部耐藥基因突變位點的局限性。

本研究結果顯示，利福平和異煙肼任一位點突變率為20.2%，與崔曉利等[6]報道陜西省西安市的19.52%相近，但明顯高于余云芳等[7]報道湖北省宜昌市的8.72%，可能與地區結核病疫情的差異有關，但也說明我市肺結核耐藥形勢嚴峻。另外，初治任一位點突變率(9.3%)和耐兩藥率(2.9%)明顯低于復治任一位點突變率(54.5%)和耐兩藥率(33.3%)，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，說明復治患者是耐藥結核病的重點關注人群。有研究認為，結核病治療史是結核病患者發生耐藥的危險因素[8]，而且由于初始強化治療肺結核推薦采用RFP+INH+EMB三聯或RFP+INH+PZA+EMB四聯方案[9-10]，未能根據患者病理生理特點行個體化用藥，如患者并發肝腎功能異常、糖尿病、艾滋病等，可能導致抗結核藥物劑量不足或劑量過高；或者由于利福平和異煙肼需空腹服用，較易產生藥物不良反應，如嘔吐、頭暈，加之療程較長等因素，導致患者較難依從，出現不規范使用、自行停藥、中斷治療等，最終致結核分枝桿菌發生多態性基因改變，產生耐藥，治療失敗[11]。

本研究411例肺結核患者中，男性患者(82.0%)遠高于女性患者(18.0%)，說明本市肺結核患者以男性為主，與全球結核病患者的性別分布報道相一致[1]。可能與男性不健康的生活方式(飲酒、吸煙、熬夜、活動范圍大、交友廣泛)有關，尤其是吸煙會損害呼吸器官的屏障作用，進一步降低肺功能，增加誘發肺結核的可能性[8]。年齡組分析顯示，結核分枝桿菌感染率隨年齡增長依次遞增，40歲以上患者達74.2%，說明中老年人為結核感染的主要人群，與杜永成等[12]報道的活動性肺結核患病率、余云芳等[7]報道的結核分枝桿菌感染率隨年齡的增長而逐漸上升且肺結核患者呈老齡化趨勢相符。另外，本研究顯示任一位點突變率在不同性別、年齡組的分布差異均無統計學意義，與梁慶福等[13]報道的福建省結核病耐藥性監測結果相符，不同于崔曉利等[6]報道的陜西省西安市僅不同性別的患者差異無統計學意義的監測結果；而且，任一位點突變率和同時對利福平和異煙肼的耐藥率高峰均在40歲以上患者中，與余云芳等[7]報道的20～歲組耐藥率(10.82%)為最高不同，可能與地域人口構成情況差異有關，也可能與40歲以上的中老年人群多并發肺部疾患、糖尿病、高血壓、冠心病、慢性腎臟病、艾滋病、惡性腫瘤、乙或丙型肝炎、自身免疫性疾病等危險因素較多，治療方案選擇難度大，藥物不良反應多，治療效果差，是耐藥結核病的易感人群有關[12，14]。

利福平是通過作用于DNA依賴的RNA聚合酶，抑制mRNA轉錄而達到殺菌作用；利福平耐藥是由于編碼RNA聚合酶的核心酶的β亞單位的基因ropB發生突變造成[15]。本研究僅ropB基因突變者22例，531(C→T)是突變頻率最高的位點，與余云芳等[7]報道的湖北省宜昌市、張煒煜等[16]報道的吉林省的檢測結果一致，是ropB基因突變最常見的突變位點。而異煙肼是通過菌體內過氧化氫-過氧化物酶的活化作用，產生自由基攻擊結核分枝桿菌細胞壁中的分枝菌酸、脂類及DNA等成分，抑制這些成分的合成，破壞細胞壁而產生強大的殺菌效應，是全效殺菌劑；但當異煙肼相關katG基因發生突變會導致異煙肼不能被活化為異煙酸，是異煙肼產生耐藥的主要原因；另外，inhA基因也是異煙肼的作用靶點，異煙肼通過編碼烯酰基還原酶使其活化并與inhA酶結合，阻礙分枝菌酸生化合成途徑，干擾脂酸合成，達到抑菌目的；當該基因發生點突變和堿基或DNA鏈缺失則可使inhA酶過度表達，致所需異煙肼濃度增高，耐藥產生[15]。本研究中，19例異煙肼相關katG基因和inhA基因中13例發生katG基因突變，突變頻率最高的位點為315(G→C)，其次為-15(G→T)，與上述作用機制相符，與林淑芳等[17]報道的福建省、余云芳等[7]報道的湖北省宜昌市、張煒煜等[16]報道的吉林省監測結果一致。42例耐利福平和異煙肼患者的基因突變中，40例為雙位點突變，突變頻率最高的是531(C→T)315(G→C)。本研究單耐利福平、單耐異煙肼、耐兩藥的耐藥率分別為5.4%、4.6%、10.2%，以耐兩藥為主，提示我市肺結核患者多樣、復雜，與陳求揚等[18]報道的福建省結核病耐藥監測結果一致，但較余云芳等[7]報道的湖北省宜昌市、張煒煜等[16]報道的吉林省研究結果更復雜多樣，說明我院耐藥情況仍較嚴峻，應加強耐利福平和異煙肼患者的個體化治療管理。

由于MDR-TB具有傳染期長、治療時間長、管理難度大、治療效果差、經濟負擔重等特點，導致耐多藥患者成為結核病的重要傳染源。既往我市對結核分枝桿菌的研究方法均采用改良羅氏(L-J)培養基進行分離培養、菌種鑒定，采用比例法進行藥物敏感性試驗，需耗時1～3個月，無法滿足臨床對MDR-TB的早發現、早診斷、早治療的要求[4-5]。本項目研究采用的基因芯片法可在6 h內檢出結核分枝桿菌復合群及其對利福平和異煙肼的相關耐藥基因突變情況，對明確我市MDR-TB疫情有重要意義。建議各縣(市、區)加強實驗室建設，對肺結核可疑癥狀者或疑似患者首診時推薦采用分子生物學方法及時快速檢測出一線抗結核藥物的藥物敏感性試驗結果，并結合耐藥監測結果指導臨床用藥，重點關注利福平和異煙肼的合理使用，為制定個體化的抗結核治療方案提供科學依據。在治療期間應加強全程規則用藥的督導管理，以提高治療有效性，減少RR-TB和MDR-TB的發生。