國產實時熒光定量PCR試劑與GeneXpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌的對比分析

呂純芳 吳健虹 盧留珠 徐陽鳳 劉盛元

結核病防控的一個重要環節是快速、有效的診斷。隨著核酸擴增技術(nucleic acid amplification test，NAAT)的發展，實時熒光定量PCR(FQ-PCR)技術在全世界各國和地區被推廣。2010年12月，WHO推薦GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)作為結核病快速診斷及對利福平耐藥性檢測的方法[1]。國產FQ-PCR試劑和GeneXpert檢測的靶基因、標本處理流程不同，后者檢測成本遠高于前者，因此本研究對國產FQ-PCR試劑和GeneXpert在痰標本中結核分枝桿菌的檢測效能進行評估和比較，為基層實驗室結核病快速核酸檢測方法的選擇提供參考依據。

材料和方法

一、研究資料

收集2017年1月至2018年12月于深圳市南山區慢性病防治院就診的210例初診疑似肺結核患者的痰標本，同時開展GeneXpert和FQ-PCR檢測。納入患者均為初次來我院就診，伴有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、低熱等臨床癥狀，或胸部影像學檢查表現與活動性肺結核相似的患者。其中，男147例，女63例；年齡14～85歲，平均年齡(35.5±16.8)歲。

二、儀器與試劑

GeneXpert MTB/RIF檢測系統與檢測試劑(美國Cepheid公司)，Ziehl-Neelsen熱染法抗酸染色液(珠海貝索生物科技有限公司)，奧林巴斯BX41顯微鏡(日本Olympus公司)，BACTEC MGIT 960系統及配套MGIT培養管、營養添加劑、抑菌劑(美國BD公司)，實時熒光定量PCR儀[LightCycler 480Ⅱ；羅氏診斷產品(上海)有限公司]，結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法；湖南圣湘生物科技有限公司)。

三、標本的采集及檢測方法

1. 標本留取、涂片染色和鏡檢：每例患者要求送早、晚、隨機痰液3份，每份分別挑取痰標本的膿樣、干酪樣部分用于涂片鏡檢(即1份痰標本涂1張玻片)；余下的3份痰液混合起來(≥3 ml)，1 ml用于MGIT 960培養，1 ml 用于GeneXpert檢測，1 ml用于FQ-PCR檢測。涂片、抗酸染色、鏡檢和結果判讀參照《現代結核病診斷技術》[2]中相關操作執行。

2. MGIT 960液體培養[3]：取適量痰標本加入50 ml離心管，視痰液性狀加入1～2倍體積4%氫氧化鈉-N-乙酰半胱氨酸(NaOH-NALC)，渦旋振蕩2～3 min，室溫放置15～20 min后加入0.1 mol pH值為6.8的無菌磷酸鹽緩沖液至50 ml；在溫度4 ℃的條件下，離心半徑10.9 cm，3000 r/min 離心15 min，小心棄上清，加入1～2 ml 0.1 mol pH值為6.8的無菌磷酸鹽緩沖液，混勻；將營養添加劑倒入雜菌抑制劑(PANTA)試劑瓶中，充分溶解混勻后吸取0.8 ml加入到MGIT 7 ml液體培養管中，然后再加入0.5 ml標本，置于MGIT 960系統內進行培養，記錄報陽的天數。

3. GeneXpert法：取1 ml痰液加入2倍痰液體積的樣本處理液，使用渦旋儀振蕩20 s左右，直至無肉眼可見塊狀痰。室溫放置15 min后用一次性無菌吸管吸取2 ml痰處理液加入到檢測匣中上機檢測，2 h后儀器自動判讀結果。檢測結果依照儀器內探針的閾值循環數(threshold cycle，Ct)判斷，5個探針中至少有2個探針Ct值≤38即為結核分枝桿菌陽性；檢測利福平耐藥基因的早期閾值和晚期閾值之差，即ΔCt值>0.35時提示檢測到利福平耐藥。并進一步按照Ct值對結核分枝桿菌進行半定量：高含量(<16)、中含量(16～22)、低含量(22～28)、極低含量(>28)。質量控制：Ct值每個檢測都含有樣本處理質量控制(SPC)和探針質量控制(PCC)，確保樣品經過正確處理和探針符合指定的接受標準，保證每個檢測合格有效。如果任一質量控制不通過，試驗結果將顯示為無效(不能確定是否檢測到結核分枝桿菌，且SPC為陰性、5個探針檢測通過)、錯誤(SPC無結果，且1個或多個探針檢測失敗；如果5個探針檢測通過，則該錯誤是由系統組件故障引起的)或無結果(SPC和PCC均無結果)。

4. FQ-PCR法：按試劑盒說明書處理痰標本，PCR反應體系為：反應液38 μl，酶混合液2 μl，內標1 μl，檢測孔加待測樣本5 μl，陰性對照孔、陽性對照孔分別加5 μl陰性對照品和5 μl陽性對照品作為質量控制，保證檢測結果合格有效。擴增程序如下：50 ℃ 2 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s、57 ℃ 30 s(45個循環)；40 ℃ 10 s。陰陽性判斷：對于測定Ct值≤39的樣本，報告為結核分枝桿菌DNA陽性；如果Ct值>39，同時內標檢測為陽性(Ct值≤40)，報告注明結核分枝桿菌DNA低于試劑盒檢測下限。

四、評價指標和計算方法

分別計算FQ-PCR和GeneXpert兩種方法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。計算公式：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%。一致性=(兩種方法檢測均為陽性例數+兩種方法檢測均為陰性例數)/檢測總例數×100%。

按照鏡檢結果分級報告標準[4]將所有標本分為6個組，即陰性組、少量組、+組、++組、+++組、++++組，分別比較各組中FQ-PCR與GeneXpert檢測Ct值均值的差異。陰性：連續觀察300個不同視野未發現抗酸桿菌(AFB)；少量：觀察300個視野可見1～8條AFB；+：每100個視野可見3～9條AFB，連續觀察300個視野；++：每10個視野可見1～9條AFB，連續觀察100個視野；+++：每個視野可見1～9條AFB；++++：每個視野可見≥10條 AFB。

五、統計學處理

結 果

一、FQ-PCR和GeneXpert兩種方法的陽性檢出情況比較

210例患者痰標本培養污染率為1.9%(4/210)，涂陽培陰率為5.6%(7/125)，均符合深圳市結核病實驗室管理考核指標(培養污染率<5%，涂陽培陰率<15%)。以MGIT 960培養為參考標準，GeneXpert檢測的敏感度為83.7%(123/147)，特異度為87.9%(51/58)，陽性預測值為94.6%(123/130)，陰性預測值為68.0%(51/75)；FQ-PCR檢測的敏感度為83.7%(123/147)，特異度為89.8%(53/59)，陽性預測值為95.3%(123/129)，陰性預測值為68.8%(53/77)，見表1。

GeneXpert檢測結果“錯誤”(5個探針至少有1個檢測失敗)1例，失敗率為0.5%(1/210)。FQ-PCR 的失敗率和污染率均為0。

表1 以培養為參考標準比較2種檢測方法檢測結核分枝桿菌的效能

注GeneXpert檢測中1例檢測結果為“錯誤”

二、FQ-PCR和GeneXpert檢測結果一致性分析

1.Kappa檢驗結果：FQ-PCR與MGIT 960一致性為85.4%[(123+53)/206](Kappa=0.70)；GeneXpert與MGIT 960一致性為84.9%[(123+51)/205] (Kappa=0.66)。見表1。FQ-PCR與GeneXpert檢測結果均為陽性的標本有124例，陰性的標本有70例，210例標本除去1例GeneXpert檢測“錯誤”，總計209例；FQ-PCR與GeneXpert一致性為92.8%[(124+70)/209](Kappa=0.85)，兩者具有較好的一致性。

2. GeneXpert與FQ-PCR檢測不一致結果：GeneXpert與FQ-PCR檢測不一致結果有16例。其中，MGIT 960培養與GeneXpert檢測均為陽性，而FQ-PCR檢測陰性有6例，對照臨床診斷結果，此6例患者均為確診結核病患者，胸部X線攝片(簡稱“胸片”)結果均為異常，已接受治療。MGIT 960培養與FQ-PCR檢測均為陽性，而GeneXpert檢測陰性有6例，對照臨床診斷結果，此6例患者均為確診結核病患者，胸片結果均為異常，已接受治療。MGIT 960培養陰性，GeneXpert與FQ-PCR檢測結果不一致有4例；其中，2例患者FQ-PCR檢測陰性、GeneXpert檢測陽性，臨床均確診為結核病，已接受治療；1例GeneXpert檢測陰性、FQ-PCR檢測陽性，臨床診斷為非活動性肺結核(無活動性肺結核相關臨床癥狀和體征，細菌學檢查陰性，并排除其他原因所致的肺部影像學改變)，醫生建議患者隨診觀察，一旦轉為活動性肺結核則立刻進行治療；1例 FQ-PCR檢測陰性、GeneXpert檢測錯誤，患者有結核病病史，現狀屬于非活動性肺結核，建議隨診觀察。

三、FQ-PCR和GeneXpert檢測相同荷菌量標本的Ct值均值比較

按照鏡檢結果分級報告標準，將所有標本分為6個組，每組標本的荷菌量依次從零、低到高。Ct值表示每個PCR反應管內熒光信號到達設定的閾值時的PCR循環數。待測樣本中結核分枝桿菌荷菌量越高，表示起始拷貝數越多，Ct值均值越小；反之亦然。FQ-PCR和GeneXpert檢測不同荷菌量標本的Ct值均值比較結果見表2。FQ-PCR法檢測陰性組的Ct值均值與少量組比較，差異有統計學意義(t=5.56，P<0.001)；GeneXpert法檢測陰性組的Ct值均值與少量組比較，差異有統計學意義(t=5.19，P<0.001)。比較兩種方法對檢測6組不同荷菌量標本的Ct值均值發現，FQ-PCR檢測陰性組標本Ct值均值與GeneXpert的差異無統計學意義，其余各組差異均有統計學意義。

討 論

隨著核酸擴增技術(NAAT)的發展和推廣，實時熒光定量PCR和GeneXpert在很多醫院開展[5-7]。兩種方法都基于核酸擴增技術，根據檢測到閾值循環數(Ct值)的大小來進行結核分枝桿菌定性；但是兩者檢測的靶基因不一樣：GeneXpert法根據rpoB基因設計了5對探針擴增81 bp的利福平耐藥決定區(RRDR)[8]；FQ-PCR法根據試劑盒不同檢測的靶基因不同，包括：插入序列6110(IS6110)、IS986、16SrRNA、MPB64、MTP40、65 kD、2個或多個序列聯合應用等[9-11]。本研究中FQ-PCR的靶基因為IS6110，該插入序列在結核分枝桿菌基因組中的拷貝數約為4～25個[12]，且為結核分枝桿菌復合群所特有，因而是結核分枝桿菌檢測的首選靶基因。

表2 FQ-PCR和GeneXpert檢測210例患者不同荷菌量標本的Ct值均值比較

GeneXpert檢測成本高，在基層推廣有一定難度，國產FQ-PCR試劑檢測成本低。因此，本研究對GeneXpert和FQ-PCR在臨床痰標本中結核病的檢測效能進行了評估和比較。以MGIT 960培養為參考標準，FQ-PCR檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為83.7%、89.8%、95.3%、68.8%；GeneXpert檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為83.7%、87.9%、94.6%、68.0%。GeneXpert的敏感度與文獻報道的檢測痰標本敏感度63.59%～100%接近[13-14]；特異度則低于文獻報道(97%～100%)[15-16]，FQ-PCR的特異度也比較低，原因可能有：(1)本研究中GeneXpert和FQ-PCR針對涂片陽性和(或)醫生高度懷疑的標本開展，涂陽比例較高，為59.5%；(2)培養陰性而分子檢測陽性的例數稍多，GeneXpert 檢測有7例，檢測結果均為極低含量(Ct值>28)；FQ-PCR有6例，Ct值范圍35～38，標本荷菌量太低可能會出現培養陰性結果，這與培養的手工操作和檢測的敏感度較低有關。兩種分子檢測陰性預測值低，原因分析為：(1)菌量太低，超出FQ-PCR 和GeneXpert的檢測下限；(2)兩種方法都沒有去污步驟，存在PCR抑制因子，在低菌量時影響較大[17]；(3)樣本量不夠大。

FQ-PCR和GeneXpert都是以Ct值大小作為定性判斷的依據：FQ-PCR以Ct值≤39報告結核分枝桿菌陽性；GeneXpert以5個探針中至少有2個探針Ct值≤38報告結核分枝桿菌陽性。按照鏡檢結果分級報告標準將所有標本分為6個組，每組標本的荷菌量從低到高。荷菌量越高，說明標本中結核分枝桿菌的拷貝數越多，FQ-PCR和GeneXpert檢測到Ct值則越小，反之亦然。通過比較各組中兩種方法的Ct值均值的差異發現，檢測涂片陰性的標本時，差異無統計學意義；檢測涂片陽性(少量、+、++、+++、++++)的標本時，FQ-PCR檢測各組Ct值均值均明顯高于GeneXpert。FQ-PCR檢測陰性組和涂陽少量組的Ct值均值比較，差異有統計學意義；GeneXpert亦然。由此可見，雖然FQ-PCR檢測涂陽標本的Ct值均值明顯高于GeneXpert，但是在定性結果上差異無統計學意義。

FQ-PCR和GeneXpert都基于PCR，因此存在分子檢測共有的缺點：不能鑒別死菌和活菌。受檢者接受過或者正在接受抗生素治療，都可能影響檢測結果的準確性。因此，本研究中出現的12例確診結核病、正在接受治療的患者，6例為MGIT 960培養與GeneXpert檢測陽性，而FQ-PCR檢測陰性，說明FQ-PCR結果為假陰性；6例為MGIT 960培養與FQ-PCR檢測陽性，而GeneXpert檢測陰性，說明GeneXpert結果為假陰性。因此，無論是FQ-PCR，還是GeneXpert，檢測結果都必須結合涂片鏡檢、結核分枝桿菌培養、胸部X線攝影結果、是否用藥等來綜合做出判斷。

綜上所述，FQ-PCR和GeneXpert對痰標本結核分枝桿菌的檢測結果一致性良好。GeneXpert法操作簡便快速且易于開展、生物安全性好，但是成本較高；FQ-PCR法要求高、對實驗環境要求也高，但國產FQ-PCR試劑檢測成本低。如果在耐藥結核病低發病率地區進行結核病大規模篩查，可以先用FQ-PCR，再針對少數陽性標本采用GeneXpert進一步做利福平耐藥性診斷，可降低臨床檢測成本。基層結核病實驗室要綜合考慮資金、技術人員、實驗室條件、篩查需求等選擇合適的核酸擴增檢測技術。