兩種技術對不同手術標本進行檢測診斷胸壁結核的價值

任航空 段李明 鄭琴芳

胸壁結核是胸外科的常見疾病，對此病的臨床診斷除了手術標本的病理學檢查之外，還包括對術后藥物治療有指導性的病原學檢測。胸壁病灶的手術標本形態差異性較大，臨床常見的手術標本包括膿液、干酪樣壞死組織、肉芽組織。對GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)和BACTEC MGIT 960液體培養(簡稱“MGIT 960”)在體液的研究較多見[1-2]，但對其在胸壁手術標本的檢測篩選卻鮮有報道。本研究將GeneXpert和MGIT 960分別作為分子生物學和細菌學的典型代表應用于胸壁疾病的手術標本檢測，研究兩種技術對胸壁結核的診斷價值，同時篩選陽性率高的手術標本類型，以期指導臨床有效利用衛生資源。

資料和方法

一、一般資料

搜集2016年6月至2019年7月西安市胸科醫院外科收治的214例疑似胸壁結核患者的臨床資料。214例患者中，男117例(54.7%)，女97例(45.3%)；年齡6～81歲，平均(45.8±17.5)歲。其中肋骨破壞114例(53.3%)，并發結核性胸膜炎42例(19.6%)，并發肺結核27例(12.6%)，并發脊柱結核8例(3.7%)，并發高血壓25例(11.7%)，并發糖尿病13例(6.1%)。通過臨床綜合診斷、病理學檢查確診胸壁結核174例，非結核性胸壁疾病40例。將外科手術獲取胸壁病灶中的膿液、干酪樣壞死組織及肉芽組織標本分別取部分組織送病理學檢查后，對3種類型手術標本同時進行GeneXpert和MGIT 960檢測。

二、胸壁結核臨床診斷標準

參考英國國家衛生與臨床優化署2016年制定的結核病診斷指南中的關于肺外結核診斷的指導意見[3]，本研究臨床診斷為胸壁結核的標準為：癥狀體征與影像學(包括B超、X線及CT檢查)發現的局部結核病灶的膿腫、肋骨破壞相符；(2)病灶標本的病理學檢查提示為干酪樣壞死并朗格漢斯肉芽腫；(3)病灶標本的微生物學或分子生物學檢查證實為結核分枝桿菌感染；(4)規律抗結核藥物治療6個月以上，結核毒性癥狀及局部癥狀消失。符合以上任意2條即診斷為胸壁結核。

三、標本的制備

手術過程中，以20 ml滅菌注射器抽取膿液，封裝后快速送檢，避免滲出血液污染膿液及生理鹽水稀釋膿液；留取干酪樣壞死組織、肉芽組織于滅菌彎盤中，用生理鹽水沖洗干凈，封裝于滅菌標本藍盒中快速送檢，避免膿液、干酪樣壞死組織、肉芽組織混雜送檢。共制備152份膿液標本、128份干酪樣壞死組織標本、138份肉芽組織標本。對3種類型標本均進行GeneXpert和MGIT 960檢測。

四、結核分枝桿菌實驗室檢測方法

1.標本處理：膿液標本依照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[4]，采用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-氫氧化鈉法進行標本處理。 肉芽組織及干酪樣壞死組織在加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS， pH 7.0)后，應用微型研磨器Fast-24(美國MP Biomeidcals公司)進行勻漿，之后直接接種或進行分子生物學檢測。

2.GeneXpert檢測：按照GeneXpert MTB/RIF操作說明進行。取1 ml經過上述第一步處理的標本于有螺旋蓋的無菌管中，然后加入2 ml標本處理液，放置于渦旋振蕩器上渦旋振蕩10 s，室溫靜置10 min，重置于渦旋振蕩器上振蕩10 s，室溫靜置5 min，使標本充分液化。吸取2 ml液化標本至GeneXpert反應試劑盒，然后將反應試劑盒放置到檢測模塊，儀器開始進行自動化檢測。反應完成后，在檢測系統窗口下可直接查看測試結果。

3.MGIT 960培養：將肉芽組織或壞死組織勻漿后，使用NALC-氫氧化鈉消化15 min,然后加入無菌PBS，3000×g離心15 min，將沉淀重新懸浮于2 ml的PBS中。將0.5 ml處理后標本接種在BACTEC MGIT 960分枝桿菌生長指示管，進行混勻，室溫靜置30 min。然后在37 ℃條件下放置在BACTEC MGIT 960儀器中進行孵育，最長時間為42 d，并定期進行監控。培養陽性標本經萋-尼抗酸染色確認，并進一步用MPB64單克隆抗體(杭州創新生物檢控技術有限公司)進行檢測，鑒定為結核分枝桿菌。膿液標本直接加消化液進行操作。以空白管作為陰性對照。

4.試劑：GeneXpert MTB/RIF試劑盒購自美國Cepheid公司， BACTEC MGIT 960含藥培養基購自珠海市銀科醫學工程有限公司。

五、統計學處理

結 果

一、GeneXpert和MGIT 960對3種類型手術標本的檢測結果

在152份膿液標本檢測中，GeneXpert和MGIT 960檢測結果均陽性47份，總的陽性份數為68份，陽性率44.7%；在128份干酪樣壞死組織標本中，兩種方法檢測結果均陽性51份，總的陽性份數為88份，陽性率68.8%；在肉芽組織檢測中，兩種方法檢測結果均陽性86份，總的陽性份數為113份,陽性率81.9%。將膿液、干酪樣壞死組織、肉芽組織的檢出陽性率兩兩比較，P值均<0.05。具體見表1。

二、以臨床診斷結果為參考標準評價GeneXpert和MGIT 960兩種方法的診斷效能

1.臨床診斷：214例疑似胸壁結核患者通過術前血液化驗、影像學資料及術后病理結果臨床最終診斷為胸壁結核174例，非結核性胸壁疾病40例(其中化膿性胸壁膿腫18例，胸壁囊腫并發普通細菌感染9例，軟組織腫瘤8例，肋骨骨髓炎3例，胸壁放線菌病2例)。

2.兩種方法的診斷效能評價：本研究共收集疑似胸壁結核214例，GeneXpert對疑似胸壁結核的診斷鑒定結果顯示有144例為陽性，70例為陰性。GeneXpert和臨床診斷的共同陽性結果為143例，共同陰性結果為39例；以臨床診斷結果為標準，GeneXpert鑒定胸壁結核的敏感度為82.18%(143/174)，特異度為97.50%(39/40)，陽性預測值為99.31%(143/144)，陰性預測值為55.71%(39/70)，Kappa值為0.618。MGIT 960培養對疑似胸壁結核的診斷鑒定結果顯示有94例為陽性，采用對硝基苯甲酸(PNB)進行菌種鑒定，培養陽性的標本中有3例為非結核分枝桿菌(NTM)，因此，最終確認為培養陽性的結核分枝桿菌標本為91例，陰性樣本為123例。MGIT 960和臨床診斷的共同陽性結果為91例，共同陰性結果為40例；以臨床診斷結果為標準，MGIT 960鑒定胸壁結核的敏感度為52.30%(91/174)，特異度為100.00%(40/40)，陽性預測值為100.00%(91/91)，陰性預測值為32.52%(40/123)，Kappa值為0.291。具體見表2。

表1 3種類型標本采用GeneXpert及MGIT 960的檢測結果(陽性率差異)比較

注在膿液檢測中，兩種方法檢測結果均陽性47份，MGIT 960培養陽性47份，GeneXpert檢測陽性68份；在干酪樣壞死組織中，兩種方法檢測結果均陽性51份，其中MGIT 960培養陽性53份，GeneXpert檢測陽性86份；在肉芽組織檢測中，兩種方法檢測結果均陽性86份，其中MGIT 960培養陽性89份，GeneXpert檢測陽性110份。MGIT 960培養陽性者經菌種鑒定為結核分枝桿菌，非結核分枝桿菌已剔除。a:膿液與干酪樣壞死組織2種標本檢測結果之間的陽性率比較，通過Bonferroni方法校正P值，0.05/3=0.017，P<0.001<0.017。b:干酪樣壞死組織和肉芽組織2種標本檢測結果之間的陽性率比較，P=0.013<0.017。c:肉芽組織和膿液2種標本檢測結果之間的陽性率比較，P<0.001<0.017

表2 GeneXpert與MGIT 960以臨床診斷為參考標準檢測胸壁結核的效能

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%=d/(b+d)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%=a/(a+b)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%=d/(c+d)×100%

GeneXpert檢測胸壁結核的曲線下面積(AUC)值為0.898， 95%的置信區間(95%CI值)為0.853～0.944；MGIT 960檢測胸壁結核的AUC值為0.761，95%CI值為0.697～0.826，GeneXpert的診斷價值高于MGIT 960(圖1)。

討 論

一、GeneXpert與MGIT 960對胸壁結核不同形態類型病灶標本檢測陽性率的比較

GeneXpert與MGIT 960是目前臨床上常用的檢測方法，在獲得病原學依據及判斷結核分枝桿菌是否耐藥方面起著重要作用。膿液標本容易獲得，但膿液中的結核分枝桿菌培養陽性率較低[5]；而肉芽組織的結核分枝桿菌培養陽性率高于膿液，但總體的病原學陽性檢出率仍不高，僅為36.8%[6]。而唐亮等[7]應用GeneXpert和細菌培養法對脊柱結核的不同類型病灶的檢測結果顯示，膿液陽性率較高[(73.02±6.33) %；(44.44±7.08) %]，肉芽組織次之[(73.02±6.33) %；(43.86±7.44) %]，干酪壞死物最低[(39.87±7.76) %；(30.72±7.31) %]，GeneXpert的檢測陽性率明顯高于細菌培養。林慶璽等[8]用聚合酶鏈式反應(PCR)法檢測活動性關節結核不同的病理材料，結果為肉芽組織的陽性率為74.42%(32/43)，明顯高于干酪樣壞死組織[58.14%(25/43)]和膿液[37.21%(16/43)]。本研究顯示，GeneXpert聯合MGIT 960檢測3種類型胸壁結核病灶標本，肉芽組織的陽性率為[81.9%(113/138)]，明顯高于干酪樣壞死組織[68.8%(88/128)]和膿液[44.7%(68/152)]。膿液與干酪樣壞死組織兩組之間的陽性率比較，通過Bonferroni方法校正P值，P<0.017，干酪樣壞死組織和肉芽組織兩組之間的陽性率比較，P=0.013<0.017，肉芽組織和膿液兩組之間的陽性率比較，P<0.017；表明2種方法對肉芽組織檢測陽性率明顯高于膿液和干酪樣壞死組織，差異均有統計學意義。與林慶璽等[8]單用PCR檢測活動性關節結核不同病理材料的研究結果一致。因此，術中留取標本的過程中，肉芽組織應作為首選的檢測材料。為了節約醫療資源，可聯合GeneXpert與MGIT 960僅對肉芽組織進行檢測，以獲得更優的檢測結果。

二、GeneXpert與MGIT 960檢測診斷胸壁結核的效能分析

GeneXpert檢測可最短在手術標本送檢后2 h獲得結果，能夠對胸壁結核進行早期診斷。GeneXpert檢測過程在全自動全封閉的狀態下進行，能夠有效避免標本處理過程中的污染問題，單從操作技術層面考慮，GeneXpert便捷、自動化、準確的優勢更宜在外科手術標本檢測中應用。本研究納入的疑似胸壁結核患者中，從術后普通細菌培養及病理結果來看，普通細菌感染占非結核性胸壁疾病的67.50%(27/40),其中包括化膿性胸壁膿腫18例，胸壁囊腫并發普通細菌感染9例，值得在外科工作中引起警惕。在診斷胸壁結核方面，GeneXpert的敏感度和特異度分別為82.18%和97.50%，與國內近4年的骨關節結核研究結果基本一致[9-11]。本研究中，GeneXpert鑒定胸壁結核的結果與臨床診斷結果的一致性較好(Kappa=0.618)，而MGIT 960鑒定胸壁結核的結果與臨床診斷結果的一致性較差(Kappa=0.291)，表明GeneXpert對疑似胸壁結核手術標本的檢測效能高于MGIT 960。本研究結果與范國萍等[12]對可疑肺結核痰液標本的研究結果一致；而MGIT 960對送檢標本的檢測時間較長，需要14～40 d不等。與GeneXpert相比，MGIT 960檢測的敏感度僅為52.30%，原因可能如下：一方面因為MGIT 960液體培養時只檢測標本中的活菌；而GeneXpert檢測的是結核分枝桿菌的DNA片段，即使為死菌，也可獲得陽性檢測結果；另一方面，可能與實驗操作人員的操作規范、操作污染等因素有關[13-14]。MGIT 960的優點是可以對檢測陽性標本進一步做一線、二線抗結核藥物的藥物敏感性試驗，從而較全面地判斷耐藥情況，而GeneXpert僅能判斷菌株對利福平是否耐藥。

三、本研究的不足之處及展望

本研究對于干酪樣壞死組織和肉芽組織僅憑肉眼分辨，后續如能篩選一些經濟情況好的患者，對送檢標本做一個病理學預判，研究所得結果將更具說服力。

綜上所述，胸壁結核不同形態的病灶中，肉芽組織是獲得病原學依據的重要標本形式；而檢測方法上，GeneXpert與MGIT 960聯合檢測，能夠提高手術標本陽性檢出率，對胸壁結核的早期診斷及后續用藥意義重大。