一株香蘭素高產菌株的復合誘變篩選

邢晨光

（廈門歐米克生物科技有限公司，福建廈門 361000）

香蘭素（Vanillin），又名香草醛、香草素；在自然環境中存在于蘆筍、咖啡、香莢蘭等植物中，具有濃厚的奶香氣味，留香持久[1-2]，是一種非常重要的食品香料；在食品、煙草、日化品中可以作為一種增香劑，提升香氣品質。由于其廣泛的使用領域，國內外所生產出的香蘭素遠遠不能滿足目前的市場需求[3-5]。

目前，市場上香蘭素的生產來源主要包括植物提取、化學合成、微生物轉化和酶法合成[6]。植物中香蘭素含量較低，導致提取收率較低、成本較大，因此植物提取的香蘭素遠遠不能滿足市場需要；化學合成法生產由于環境污染等問題也越來越受到抵制，因此微生物轉化以及酶合成法已經成為了生產香蘭素的一種趨勢，成為后續研究發展的重要方向[7]。

本文采用以沙鏈霉菌（Streptomyces psammoticus）OMK-4為出發菌株，采用紫外誘變、NaNO2誘變以及復合誘變的方法，在原有基礎上篩選出一株高產且具有穩定遺傳的香蘭素菌株。該研究結果對微生物安全、高效篩選香蘭素高產菌株以及香蘭素的工業化生產都具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 原始菌株

沙鏈霉菌OMK-4，保藏于廈門歐米克生物科技有限公司菌種室。

1.2 主要設備

高效液相色譜（美國安捷倫，1260Ⅱ）、高效氣相色譜（日本島津，GC-2030）、生物傳感器（山東科學院，SBA-40E）、紫外分光光度計（日本島津，UV-1780）、pH計（瑞士梅特勒，S-210S）、搖床（上海博訊，BSD-YX2600）、生物安全柜（新加坡ESCO，AC2-5S1）等。

1.3 主要試劑

1.3.1 分析純試劑：

香蘭素標品（sigma）、阿魏酸標品（sigma）、硝酸鉀（西隴科學）、硫酸亞鐵（西隴科學）、亞硝酸鈉（西隴科學）、磷酸二氫鉀（西隴科學）、磷酸氫二鉀（西隴科學）、硫酸銨（西隴科學）、碳酸鈣（西隴科學）、氯化鈉（西隴科學）、可溶性淀粉（西隴科學）、硫酸鎂（西隴科學）、酵母浸粉（OXOID）、尿素（西隴科學）等。

1.3.2 化學純試劑

玉米漿粉（天津利隆生化）、瓊脂（北京中科昆蟲生物）、斐林試劑（北京萬佳首化生物）

1.4 主要培養基

1.4.1 固體平板培養基

可溶性淀粉20.0 g，氯化鈉 l0.5 g，硝酸鉀 1.0 g，磷酸氫二鉀 0.5 g，硫酸鎂 0.5 g，硫酸亞鐵 0.01 g，瓊脂25.0 g；水1 000 mL；pH 7.4～7.6。

1.4.2 種子培養基

可溶性淀粉3.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，尿素0.3 g，硫酸鎂0.1 g，碳酸鈣0.3 g，酵母浸粉1.0 g，玉米漿粉1.0 g，硫酸銨0.6 g，阿魏酸0.2 g；水1 000 mL；pH 7.5左右。

1.4.3 發酵培養基

可溶性淀粉5.0 g，磷酸二氫鉀 0.3 g，尿素 0.5 g，硫酸鎂0.1 g，碳酸鈣 2.0 g，酵母浸粉1.0 g，硫酸銨0.5 g，阿魏酸2.0 g；水1 000 mL，pH 7.5～8.5。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體濃度

取培養液用蒸餾水稀釋一定倍數后混勻，在620 nm波長下，利用分光光度計測定吸光度。

1.5.2 殘糖測定

采用斐林試劑滴定法進行測定。

1.5.3 香蘭素含量的測定

采用HPLC進行香蘭素含量的檢測，檢測條件為：色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6*150 mm，流動相為0.1%磷酸緩沖液∶甲醇（Av/Bv）=55∶45，流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為280 nm紫外檢測，進樣量為0.5 μL。

1.6 菌懸液的制備

將菌種OMK-4接種于裝有高氏1號培養基的試管斜面中，放于恒溫培養箱，37 ℃培養24 h。取10 mL無菌水清洗試管斜面中的菌體，倒入裝有玻璃珠的無菌錐形瓶中，充分震蕩均勻后得到菌懸液，根據需要進行梯度稀釋獲得105CFU/mL的菌懸液。

1.7 紫外條件下誘變OMK-4

取10 mL菌懸液放于無菌培養皿中，培養皿距離20 W紫外燈30 cm，分別照射0 s、10 s、30 s、50 s、70 s、90 s、120 s和150 s。照射完畢后將其放置在暗室中靜置30 min備用。將照射過的菌懸液稀釋后取0.5 mL涂布至高氏1號培養基中，涂布均勻，凝固后制成計數板，倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，每個濃度取3個對照，記錄菌數，計算紫外誘變的致死率。

1.8 亞硝酸鈉誘變處理OMK-4

將10 mL含有0 mol/L、0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.20 mol/L、0.25 mol/L和0.30 mol/L亞硝酸鈉的無菌水溶液分別加入100 mL的無菌三角瓶中，每瓶加入配置稀釋好的菌懸液5 mL，每個梯度3個平行。將以上樣品分別放置于震蕩搖床中，37 ℃、200 r/min的條件下分別震蕩培養1 min、3 min、5 min、7 min、9 min，培養完成后加入一定量的磷酸氫二鈉無菌水溶液做為終止劑，終止誘變。稀釋后取0.5 mL涂布至高氏1號培養基中，涂布均勻，凝固后制成計數板，倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，每個濃度取3個對照，記錄菌數及亞硝酸鈉誘變的致死率。

1.9 紫外-亞硝酸鈉復合誘變處理OMK-4

取10 mL菌懸液放于無菌培養皿中，置于20 W紫外燈的30 cm處，分別照射30 s、50 s、70 s、90 s、120 s和150 s。照射完畢后將其放置于暗室中靜置30 min，向各個培養皿中加入0.15 mol/L的亞硝酸鈉在37 ℃、200 r/min條件下震蕩培養5 min。誘變完成后立即加入一定量的磷酸氫二鈉水溶液終止反應。稀釋后取0.5 mL均勻涂布至高氏1號培養基中，凝固后制成計數板，倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，每個濃度取3個對照，記錄菌數并計算紫外-亞硝酸鈉復合誘變的致死率。

1.10 誘變菌株穩定性實驗

將紫外誘變、亞硝酸鈉誘變、紫外-亞硝酸鈉復合誘變通過隔代培養篩選出的菌株在固體培養基中連續傳代10代，每一代培養32 h。培養結束后將其接種于種子培養基中，24 h后移種至發酵培養基中，發酵36 h后檢測發酵液中香蘭素的含量。

2 結果與討論

2.1 紫外誘變最佳條件及穩定性實驗

使用功率為20 W的紫外燈，照射距離為30 cm，對菌懸液進行0～150 s的處理，記錄菌落數并計算紫外誘變的致死率，結果如圖1所示。隨著照射時間的延長，致死率逐漸增大；當照射時間為30 s時，菌株的致死率達到45.1%；照射時間為70 s時，致死率為83.4%；照射時間超過110 s，致死率達到100%。

圖1 紫外誘變不同時間菌株的致死率

紫外照射10 s、30 s、50 s、70 s和90 s后的誘變菌株，分別命名為Z1、Z2、Z3、Z4和Z5，其發酵液中香蘭素的含量如圖2所示。菌株Z4（紫外照射70 s）發酵產香蘭素的效果較好，最終香蘭素產量達到了23.9 g/L，且經過10代的傳代培養，遺傳性狀穩定，產量是原始菌株OMK-4的1.35倍。

圖2 紫外誘變后菌株產香蘭素含量

2.2 亞硝酸鈉誘變最佳條件和穩定性實驗

使用不同濃度的亞硝酸鈉分別處理菌株不同時間，終止反應后將其稀釋涂布在平板上，培養24 h記錄菌落數；由此得出亞硝酸鈉誘變的致死率，結果如圖3所示。當亞硝酸鈉濃度超過0.2 mol/L，菌株在誘變過程中致死率基本達到100%；當亞硝酸鈉濃度為0.05～0.10 mol/L，菌株在誘變過程中的致死率低于65.23%；當亞硝酸鈉濃度為0.15 mol/L時，菌株在誘變處理過程中處理9 min時達到100%致死率，處理1 min時致死率為21.15%，效果較為明顯。

圖3 亞硝酸鈉誘變不同時間菌株的致死率

選用0.15 mol/L作為亞硝酸鈉誘變的最優處理濃度，在其處理的不同時間下選取一株生長態勢最優的菌株，分別命名為Y1、Y2、Y3和Y4；這些菌種發酵液中香蘭素的含量如圖4所示。菌株Y3在誘變過程中發生了正突變，產量高達23.78 g/L；經過傳代10代的培養，遺傳性狀穩定，產量是初始菌株的1.37倍。

圖4 亞硝酸鈉誘變后菌株產香蘭素含量

2.3 紫外-亞硝酸鈉復合誘變菌株的篩選和穩定性實驗

按照1.9的處理方法對菌株進行復合誘變，得出菌株復合誘變篩選的致死率，其結果如表1和圖5所示。紫外誘變10 s、0.15 mol/L亞硝酸鈉處理3 min，致死率達到44.4%；紫外誘變50 s、0.15 mol/l亞硝酸鈉處理3 min，致死率達到了90.5%；紫外誘變70 s、0.15 mol/l亞硝酸鈉處理3 min，致死率達到100%。因此可知在0.15 mol/L亞硝酸鈉處理3 min、0～50 s的紫外照射條件下，菌株致死率變化較大。

圖5 復合誘變不同時間菌株的致死率

從復合誘變的涂布平板上各選擇一株生長態勢優良的菌株進行傳代培養，分別命名為F1、F2、F3，其傳代培養10代后發酵36 h的發酵液中香蘭素的含量如圖6所示。菌株F2和F3在誘變過程中均發生了正突變，經過10代遺傳后，香蘭素產量均高于初始菌株；其中，菌株F2香蘭素產量為24.1 g/L是初始菌株產香蘭素的1.39倍；菌株F3香蘭素產量為24.81 g/L，是初始菌株產香蘭素的1.43倍。

表1 復合誘變篩選對菌株致死率的影響

圖6 復合誘變后菌株產香蘭素含量

2.4 菌株發酵上罐實驗

將菌株Z4、Y3、F2、F3分別進行30 L發酵罐實驗，考察誘變菌株上罐后生長濃度及香蘭素產量，其結果如圖7所示。4株菌株發酵產香蘭素的濃度均比原始菌株要高，其中最低的菌株Z4比原始菌株高出35.5%；菌株F3產量最高，比原始菌株高出44.4%。在菌體濃度方面可以看出菌株F3菌體濃度最高，生長優勢明顯。因此，在發酵周期一致的情況下，誘變菌株F3比原始菌株菌體濃度提高到原有濃度的1.1倍，香蘭素濃度是原始菌株的1.45倍，達到24.98 g/L。

圖7 不同誘變菌株30L發酵菌體濃度和香蘭素濃度

3 結論

通過紫外照射誘變、亞硝酸鈉化學誘變以及紫外-亞硝酸鈉復合誘變，共計篩選出4株新的菌株，產香蘭素含量均比原始菌株要高，其中通過復合誘變篩選獲得的菌株F3，香蘭素效價比原始菌株提高了44.4%，為香蘭素的工業化生產提供了重要的數據支持。