小花棘豆Alternaria oxytropis內生真菌酵母氨酸還原酶基因的Southern blot檢測分析

珠麗，盧萍，席領軍，高峰，李玉玲，姜凱

（內蒙古師范大學生命科學與技術學院，內蒙古呼和浩特 010022）

小花棘豆（Oxytropis glabra DC.）是豆科棘豆屬多年生草本植物，許多植株內含生物堿苦馬豆素（swainsonine，SW），國際上將含SW的棘豆屬（Oxytropis）、黃芪屬（Astragalus）等有毒植物統稱為瘋草，而SW是引起動物瘋草病的唯一毒素[1]。SW陽離子半椅式構象與甘露糖陽離子構象類似，可與甘露糖苷競爭性結合抑制α-甘露糖苷酶Ⅰ和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性[2]，造成細胞功能紊亂，使牲畜出現中毒癥狀，嚴重時致死。通過對小花棘豆的研究發現，凡能夠分離或檢測到Alternaria oxytropis內生真菌的植株均含SW，且體外培養該內生真菌合成了SW，從而提出小花棘豆的SW毒性由該內生真菌引起。

瘋草內生真菌酵母氨酸還原酶基因（saccharopine reductase gene，sac）編碼酵母氨酸還原酶[3-4]催化賴氨酸轉化為酵母氨酸后，生成的α-氨基己二酸半醛是內生真菌合成SW的一個重要前體[5]。前期實驗中克隆到A.oxytropis的sac cDNA（KJ944635）和基因（KY052048），獲得sac缺失突變體M1，發現酵母氨酸還原酶促進真菌SW的合成。

Southern blot由Southern[6]于1975年創建，是分析基因結構和檢測特定DNA片段的經典技術，可檢測外源目的基因是否已轉入并整合到生物染色DNA上，同時可對外源片段拷貝數進行分析。Southern blot中使用的標記探針有放射性同位素和非放射性兩類，其中放射性探針靈敏度較高，但半衰期短，且有放射性輻射；非放射性標記又分為生物素標記和地高辛標記，非同位素標記探針可避免放射性危害，且由于生物體內沒有地高辛，可更好地消除內源背景，應用效果更好[7]。

Southern blot操作程序繁瑣，對基因組DNA的提取、純化、酶切等均有較高要求，要獲得理想雜交結果需反復摸索，雖可使用相關試劑盒，但需根據具體情況優化雜交方案。本研究利用PCR制備地高辛（DIG）標記探針，并對Southern blot方法進行了探索和優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種

供試菌種：小花棘豆A.oxytropis內生真菌野生株OW7.8和sac缺失突變株M1由本實驗室提供。

1.1.2 主要試劑

質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒，購自Axygen；真菌基因DNA 提取試劑盒、核酸共沉劑、限制性酶、6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker，購自Takara；核酸染料購自Bio TAQ；DIG標記試劑盒、Hyb高效雜交液，購自北京美萊博醫學科技；氨芐青霉素、潮霉素 B，購自sigma；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺ZHJH-1109 型，上海智城分析儀器制造有限公司生產；真菌培養箱MGC-350BP-2型，上海一恒科技有限公司生產；冷凍離心機3-18K/D-37520 型，德國 SIGMA生產；超微量測濃儀Q5000型，美國 Quawell生產；PCR 擴增儀050-810Tgradient48 型，德國Biometra-grandien生產；全自動高壓滅菌鍋HVE-50 型，日本 HIRAYAMA生產；電泳儀BG-Power 600型，北京百晶生物技術有限公司生產；凝膠成像系統BG-gds AUTO，北京百晶生物技術有限公司生產；超聲波清洗器PS-20，潔康超聲波設備有限公司生產；Hybridization oven OV4000，德國耶拿分析儀器公司生產；隔水培養箱GH6000，天津泰斯特儀器生產。

1.2 方法

1.2.1 PCR法制備DIG標記探針

根據內生真菌sac中間序列設計特異性引物DSF/DSR和SEMF/SEMR，以pTOPO-sac1（含內生真菌sac）為模板制備野生型探針。PCR反應體系為：pTOPO-sac11.0 μg，10×PCR Buffer 2.0 μL，DigdUTP 1.0 μL，rTaq酶1.0 μL，上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），ddH2O補足至20 μL。引物DSF/DSR的PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s； 57 ℃30 s；72 ℃ 1 min，30次循環；72 ℃ 10 min。引物SEMF/SEMR的PCR反應條件：95 ℃ 5 min，（95 ℃30s，62 ℃ 30s，72 ℃ 30s）×30，72 ℃ 10 min。

根據pCB1003（含hph）質粒上的hph序列設計特異性引物HGF/YGR，以質粒為模板制備突變型探針。PCR反應體系除模板其余與上面體系相同。PCR反應條件與DSF/DSR的相同。引物序列見表1。

在做標記反應的同時，做一個相同體系非標記PCR。反應結束后取標記和非標記PCR的擴增產物進行電泳檢測（1%瓊脂糖），剩余探針保存于-20 ℃，用于后續實驗。

表1 PCR引物序列

1.2.2 基因組DNA提取、酶切與轉膜

（1）真菌基因組DNA提取

將OW7.8和M1接種于PDA培養基上，M1培養基含潮霉素B（終濃度為50 μg/mL），接種后置于25 ℃培養箱中培養14 d。

刮取50 mg菌絲體放入預冷研缽中，加液氮迅速研磨至粉末，后置離心管中，加500 μL 4×CTAB提取液（含1% β-巰基乙醇）、4 μL RNase（100 mg /mL）充分搖勻，65 ℃水浴保溫40 min，再加等體積酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）混勻，4 ℃12000r/min離心5 min。在上清液中加2.5倍體積預冷無水乙醇，4℃12000r/min離心15 min，棄上清液。70%乙醇離心洗滌兩次，4℃12000r/min離心5 min，棄上清液，80℃烘10 min，加100μL ddH2O，37 ℃水浴1 min，測定DNA濃度及OD值，取5μL進行電泳檢測。

（2）基因組DNA限制酶切反應

選擇限制性內切酶Eco RⅤ、Pst Ⅰ、Pci Ⅰ、PvuⅡ進行酶切反應，總體積50 μL，反應體系見表2和表3?；蚪MDNA終濃度調至20 ng，于37 ℃酶切12 h，視情況延長反應時間至完全酶切，65 ℃保溫10 min，停止反應。使用核酸共沉劑進行酶切產物的純化和濃縮，用瓊脂糖凝膠電泳檢測（0.8%）。

表2 OW7.8基因組DNA酶切反應體系

（3）轉膜和固定

向上毛細管轉移20 h以上。轉膜結束后，用凝膠成像系統檢測效果。取膜，切右上角標示方向。將尼龍膜浸入6×SSC溶液中5 min，80 ℃烘烤2 h，進行膜固定，固定后用于雜交。

表3 突變株株基因組DNA酶切反應體系

1.2.3 Southern blot

加Hyb高效雜交液50 ℃預雜交3 h（15 r/min）以封閉非特異性位點。標記好的探針（25 ng/mL）沸水浴10 min后立即冰浴10 min備用。倒掉預雜交液，加入50 ℃ 5 mL Hyb高效雜交液及變性地高辛標記探針（1～3 μL/膜，5～20 ng探針/mL Hyg雜交液）混勻，50 ℃雜交過夜。

取出尼龍膜50 ℃水浴震蕩洗滌，室溫封阻尼龍膜30 min、結合抗體30 min、洗抗體兩次（15 min/次），加300μL NBT/BCIP顯色底物于37 ℃培養箱中避光顯色20 h后，短時間暴露于光下用50 mL ddH2O洗膜5 min，停止顯色，拍照記錄[8-12]。

2 結果

2.1 PCR法制備地高辛（DIG）標記探針

內生真菌sac探針電泳結果如圖1所示，泳道1為非標記sac PCR反應產物，泳道2為DIG標記的sac探針，其電泳條帶約709 bp，與預期結果相同。hph探針電泳結果如圖2所示，泳道1為DIG標記的hph探針，泳道2為同樣條件下的非標記PCR反應產物，電泳條帶約879 bp，與預期結果相同。標記反應PCR產物中帶非同位素的配體（生物素、地高辛等），其電泳遷移率慢于非標記PCR產物。

圖1 OW7.8探針DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 M1探針DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 OW7.8及M1基因組DNA限制性酶切與轉膜

將提取的OW7.8和M1基因組DNA（終濃度為20.75±7.64 μg）用Eco RⅤ、Pst Ⅰ、Pci Ⅰ和Pvu Ⅱ限制酶進行切割，酶切產物濃度為202.6±13.8 ng/μL，OD 260/OD 280在1.88～2.01，電泳結果如圖3所示。其中泳道1為野生株基因組DNA，泳道2、3為用限制酶Eco RⅤ、Pst Ⅰ酶切OW7.8基因組DNA后產物，由圖可見酶切后泳道呈彌散狀，無明顯條帶，說明酶切效果較好。泳道4、5為使用限制酶為Pci Ⅰ、Pvu Ⅱ酶切M1基因組DNA后的產物，結果顯示泳道4酶切反應不完全，泳道5酶切反應完全。分別將OW7.8基因組用限制酶Eco RⅤ再進行酶切，將M1基因組用限制酶PciⅠ再進行酶切，結果如圖4，可看到酶切反應進行徹底。轉膜后觀察凝膠結果如圖5，凝膠上沒有任何殘留DNA，說明酶切產物已全部移至尼龍膜。

圖3 基因組DNA酶切產物

圖4 基因組DNA酶切產物

圖5 轉膜后的凝膠

2.3 Southern blot

由內生真菌sac特異性探針與M1基因組DNA和OW7.8基因組DNA酶切產物進行Southern blot試驗，結果如圖6所示。泳道1表示sac探針與Pvu Ⅱ切割M1基因組DNA雜交，雜交結果呈陰性，表明M1中sac已被敲除；泳道2和3分別用Eco RⅤ和Pst Ⅰ切割OW7.8基因組DNA進行雜交，雜交結果呈陽性，說明野生株有sac，且基因的拷貝數為1。

由hph特異性探針與M1基因組DNA和OW7.8基因組DNA酶切產物進行Southern blot試驗，結果如圖7所示。泳道1表示hph探針與Pvu Ⅱ切割M1基因組DNA雜交，發現M1雜交結果呈陽性，說明標記基因hph成功整合到M1基因組中；泳道2和泳道3分別用hph特異性探針與Eco RⅤ和Pst Ⅰ切割的OW7.8基因組DNA雜交，結果呈陰性，OW7.8基因組中無hph，M1中sac已被敲除，且標記基因hph已整合到基因組上。

圖6 野生型探針雜交

圖7 突變型探針雜交

3 討論與結論

Southern blot過程較繁瑣，需注意細節頗多，本研究用PCR法制備DIG標記探針時設計了6對特異性引物，經優化選擇出兩對特異性高且擴增產物長度適宜的引物，發現若擴增產物低于300 bp，則DIG摻入較少，而探針過長則DIG摻入過多，導致非特異性雜交。張明琴等[8]用900 bp探針進行雜交，雜交信號較強。另外，在探針標記前要優化PCR反應條件，包括引物、退火溫度、延伸時間、模板量等，減少非特異性擴增，從而降低雜交背景值，避免出現假陽性。

Southern blot對基因組DNA的質量要求高，本研究在CTAB法基礎上進行了改進[9]，菌絲研磨要充分快速（2 min內），避免降解；渦旋振蕩使菌絲與裂解液混勻，使DNA充分釋放。對裂解時間也進行了探索，發現40 min利于基因組DNA釋放。

實驗中在45～65 ℃范圍內設置了5個溫度，發現50 ℃時雜交效果最好。雜交膜的選擇也相當重要，試驗發現使用尼龍膜比硝酸素纖維膜的雜交信號強。雜交液純度也會影響雜交結果，分別用過濾前后的雜交液進行雜交，發現過濾后的雜交背景低、無假陽性、雜交信號較強，而未過濾雜交液則背景值高、無雜交信號。雜交膜用TE漂洗2次后封存，膜干燥或久置后，信號將會有所減弱或褪色，但經TE潤濕后仍然會重現原有的雜交信號[10]。

Hyb高效雜交液適合在帶正電荷尼龍膜上進行Southern和Northern雜交分析，其獨特配方和操作規程僅需雜交6～12 h，而常規雜交則需要12～24 h。另外，Hyb高效雜交液能明顯降低背景，使Southern膜上單拷貝基因和Northern膜上低拷貝RNA得以檢出，也適于各類cDNA表達芯片雜交和探針標記。

設計DIG標記探針，利用Southern blot技術檢測了小花棘豆內生真菌OW7.8和M1菌株，結果表明OW7.8中有sac中間序列，而在M1中被hph替換，說明sac已被敲除。sac基因以單拷貝形式存在于OW7.8基因組中。