用于抑制SPR晶片表面非特異性結(jié)合的親水性聚合物PHMP涂層的制備及表征

陳剛，李子寅，邵彪＊

（1.南通市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇南通 226011；2.蘇州蔻美新材料有限公司，江蘇蘇州 215163）

生物傳感器是檢測領(lǐng)域中一種重要的工具，它通過將生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件結(jié)合，實現(xiàn)對目標物成分的分析和監(jiān)測，具有選擇性好、無需試劑、操作簡便、可重復(fù)使用及在線分析等優(yōu)點[1]。近年來，各種基于不同原理的生物傳感器被開發(fā)并用于醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品檢驗等領(lǐng)域[2]，其中，一種利用免疫原理和表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）相結(jié)合的技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注[3-5]。SPR利用了金屬薄膜的表面等離子體共振效應(yīng)，通過在晶片表面修飾生物分子識別膜，當(dāng)待測樣品流過芯片表面時，樣品中的目標分子與生物分子識別膜的相互作用會引起金膜表面折射率變化，從而引起SPR角的變化，通過檢測SPR角度變化，可以獲得被分析物的濃度、親和力、動力學(xué)常數(shù)和特異性等信息[6]。

基于抗體-抗原免疫反應(yīng)的SPR晶片由于其較高的特異性和測量精度，具有良好的發(fā)展前景[7-9]。然而，SPR的應(yīng)用依賴于晶片在高度復(fù)雜介質(zhì)中的穩(wěn)定性。例如，在附著抗體的表面上，金表面極易與血清蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合,這種分子與表面的非特異性結(jié)合會影響目標分析物的信號[10]。因此，為了獲得相對穩(wěn)定和靈敏的測量結(jié)果，一些研究使用生物相容性聚合物對SPR晶片進行修飾，并證明通過生物相容性的修飾可減少SPR用于尿液、血液和血清中目標分子分析的非特異性結(jié)合[11-14]。

本研究使用了一種2-甲基丙烯酸羥乙酯、2-甲基丙烯酰氧乙基氧羰基對苯疊氮、多乙二醇甲基丙烯酸酯基對硝基苯酚甲酯共聚物（PHMP）作為SPR傳感器涂層，該涂層在為抗體提供結(jié)合位點的同時減少了SPR晶片表面的非特異性結(jié)合，從而有助于SPR晶片在復(fù)雜生物質(zhì)環(huán)境中實現(xiàn)較高靈敏度和精確度的分析。

1 材料與方法

1.1 材料

2-甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）、氯化亞砜、對疊氮苯甲酸、對硝基苯酚氯甲酯（NPC）、3-巰基丙酸乙酯，購自Sigma Aldrich；多乙二醇甲基丙烯酸酯，購自NOF有限公司。三乙胺（TEA）為89℃蒸餾精制后使用，其余溶劑試劑均為分析純且無需進一步純化。

1.2 2-甲基丙烯酰氧乙基氧羰基對苯疊氮（MPAz）的合成

將亞硫酰氯（37 g，0.10 mol）和對疊氮苯甲酸（12 g，0.080 mol）加入到苯（74 g，0.90 mol）中并在80℃加熱4 h。過濾后，減壓蒸餾除去苯和亞硫酰氯，將得到的對疊氮苯甲酰氯溶解在石油醚（60 g）中并過濾除去未反應(yīng)的對疊氮苯甲酸。減壓蒸餾除去石油醚以獲得對疊氮苯甲酰氯。將對疊氮苯甲酰氯（9.0 g，0.050 mol）、氯仿（90 mL）加入300 mL三頸圓底燒瓶，在0℃下逐滴加入HEMA（0.050 mol）和TEA（0.050 mol）并在室溫下攪拌反應(yīng)12 h。使用含有氯化氫（0.050 mol）的水洗除去未反應(yīng)的HEMA和TEA，含有MPAz的氯仿溶液經(jīng)無水硫酸鎂脫水后過濾，并減壓蒸餾除去氯仿，得到黃色油狀液體MPAz。

1.3 多乙二醇甲基丙烯酸酯基對硝基苯酚甲酯（PEMN）單體的合成

將NPC（20.2 g，0.10 mol）、氯仿（180 mL）加入500 mL三頸圓底燒瓶，在0℃下逐滴加入多乙二醇甲基丙烯酸酯（乙二醇聚合度為10，65.1 g，0.10 mol）和TEA（0.10 mol）并在室溫下攪拌反應(yīng)12 h，使用含有氯化氫（0.050 mol）的水洗除去未反應(yīng)的多乙二醇甲基丙烯酸酯和TEA，使用乙醚沉淀得到黃色油狀液體PEMN。

1.4 聚合物PHMP的合成

聚合物PHMP可通過常規(guī)的自由基聚合反應(yīng)獲得，聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。將HEMA、MPAz、PEMN單體溶解在乙醇中，加入引發(fā)劑AIBN，聚合反應(yīng)在65 ℃進行12 h。聚合物通過加入到過量的乙醚和氯仿（3/1體積）中沉淀純化。聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過1HNMR確定，聚合物的分子量通過凝膠滲透色譜法（GPC）測量，含有10 mmol/L溴化鋰的甲醇和水的混合物（7/3體積）用作洗脫劑。

圖1 PHMP的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.5 光誘導(dǎo)枝接在金表面制備聚合物涂層

本研究使用鍍金二氧化硅襯底（在二氧化硅表面濺射10 nm鉻和100 nm金）用于聚合物涂層的表征。使用氧等離子體處理10min清潔表面，將基底浸入EMP的乙醇溶液（20 mmol/L）中8 h，使用乙醇和去離子水沖洗除去過量的EMP。將含有0.5%質(zhì)量百分比的PHMP乙醇溶液滴加在基底表面，通過1 min的紫外線照射（254 nm，80 mW/cm2）制備聚合物涂層。用乙醇和去離子水交替沖除去未枝接的聚合物。

1.6 在聚合物涂層表面結(jié)合抗體

將抗促甲狀腺激素（anti-TSH）鼠免疫球蛋白（IgG）濃度為20 μg/mL的PBS（pH=8.4，濃度為0.1 mol/L）滴加在聚合物涂層修飾的表面，在25 ℃保持10 h后PBS（pH=7.0，濃度為0.1 mol/L）和去離子水交替沖洗表面。表面元素組成分析通過X光電子能譜（XPS，聚焦單色鎂KαX光源）進行。

1.7 SPR晶片的制備及表征

按1.5、1.6的步驟處理鍍金SPR晶片并結(jié)合抗體。為了驗證聚合物涂層對非特異性結(jié)合的抑制作用，分別使用未經(jīng)處理和處理后的SPR晶片，以0.5 mL/min的流速注入含10 mg/mL的牛血清蛋白（BSA）溶液，監(jiān)控SPR角度的變化。特異性結(jié)合的驗證則使用修飾過的晶片，將含有500 ng/mL TSH的牛血清蛋白（BSA，10 mg/mL）溶液以0.5 mL/min的流速注入，并以不含TSH的BSA溶液作為對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物合成

聚合物PHMP可通過自由基聚合合成，合成結(jié)果總結(jié)在表1中。聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)由1HNMR譜圖中化學(xué)位移為3.7 ppm（與羥基相鄰的亞甲基）、7.0 ppm（與疊氮相鄰的苯環(huán)）、8.9 ppm（與硝基相鄰的苯環(huán)）的峰確定。

表1 PHMP的合成結(jié)果

2.2 XPS表征

如圖2所示，晶片表面的元素組成信息由XPS提供。N1s的峰在未經(jīng)處理的晶片表面不存在，而在聚合物修飾后的表面則在400.1eV和406.7eV處有兩個峰，分別來自于疊氮反應(yīng)后生成的酰胺和PEMN中的硝基。而在搭載有抗體的晶片表面，N1s的峰出現(xiàn)在401.1eV處，來自于抗體中的酰胺。這一結(jié)果證實了可通過光反應(yīng)枝接和活性酯的胺解依次將聚合物和抗體結(jié)合在金襯底表面。

圖2 晶片表面的XPS圖譜（N1s）

2.3 聚合物涂層對非特異性結(jié)合的抑制作用

為了在復(fù)雜生物質(zhì)環(huán)境中使用SPR傳感器，必須減少來自血液或體液中生物分子非特異性結(jié)合的信號。未經(jīng)處理的SPR傳感器在復(fù)雜生物質(zhì)環(huán)境中很容易由于生物分子的非特異性結(jié)合而失效。在本實驗中，BSA溶液流過未經(jīng)處理的SPR傳感器時，非特異性結(jié)合引起的SPR角度變化約為0.217°（圖3A），該信號為抗體-抗原結(jié)合信號的10～20倍，致使目標分子的信號難以從待測物中區(qū)分。而BSA溶液流過表面修飾過的SPR傳感器時，非特異性結(jié)合引起的SPR角度變化約為0.035°（圖3B），證明聚合物涂層有效減少了來自BSA的非特異性結(jié)合。

圖3 BSA注入SPR晶片引起的SPR角變化

2.4 抗體與TSH的特異性結(jié)合

當(dāng)TSH和BSA混合溶液注入SPR晶片時，TSH與抗體的特異性結(jié)合和BSA的非特異性結(jié)合共同引起SPR角的變化。在扣減非特異性結(jié)合的信號后，得到的TSH信號如圖4所示，可見500 ng/mL的TSH引起的SPR角變化為0.0147°，SPR晶片的性能因數(shù)（Performance Factor，PF）可以用特異性結(jié)合角度變化與非特異性結(jié)合角度變化的比值來衡量，在此實驗中，經(jīng)過涂層修飾的SPR晶片的性能因數(shù)為0.42。

圖4 TSH+BSA注入有涂層的SPR晶片引起的SPR角變化（已扣減非特異結(jié)合的信號）

3 結(jié)論

本研究合成了一種親水性聚合物PHMP并將其通過光反應(yīng)枝接的方法用于SPR晶片表面修飾。實驗證明經(jīng)過修飾的鍍金SPR晶片能夠減少蛋白質(zhì)與晶片表面的非特異性結(jié)合。本研究進一步將修飾后的SPR晶片搭載TSH抗體并用于模擬體液中TSH的檢測，經(jīng)實測，該方法得到的SPR晶片性能因數(shù)為0.42。