茯磚茶中冠突散囊菌的分離與篩選

皇甫瑞娟

（寧夏工商職業技術學院能源化工學院，寧夏銀川 750021）

冠突散囊菌屬于散囊菌目發菌科散囊菌屬，是茯磚茶在特定溫度、濕度條件下，通過“發花”工藝長成的自然益生菌體，俗稱“金花”[1]，是黑茶茯磚茶在“發花”過程中的優勢菌之一[2]。茶體表面和磚茶茶體內部大量肉眼可見的金色顆粒，即為“金花”，是冠突散囊菌產生的閉囊殼。“金花”是形成磚茶獨特品質和風味的主要因素，也是評價茯磚茶品質好壞的重要指標[3]。經過國內研究者的不斷研究，發現“金花”對發酵茶的品質并無影響，反而會分泌淀粉酶及氧化酶，從而催化茶葉中淀粉向單糖的轉化過程，同時使得多酚類化合物氧化，讓茶湯變得棕紅。同時湖南大學劉仲華教授等的研究[4,5]，已經證明磚茶中的“金花”菌具有顯著的降糖、減脂功效，并發現了兩種特有的活性物質——伏茶素A和伏茶素B，它們能夠有效地調節人們的新陳代謝，并在促進降脂、降壓、調節血糖等方面有很好的功效。本文運用基礎微生物研究的方法，對黑茶中的“金花”菌進行分離純化后得到純菌株，為進一步研究冠突散囊菌的生物活性及應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器設備

實驗用樣品茶為市面上出售的3種品牌（熙牧源茯茶，涇渭茯茶，涇陽茯茶）的黑茶及茯磚茶；試驗中用到的儀器有ZDP-150型振蕩培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）、LDZX-50FB立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）、B1-220A雙目生物顯微鏡（麥克奧迪MOTIC）。

1.2 試劑與培養基

馬鈴薯淀粉培養基（PDA）：馬鈴薯100 g，葡萄糖10 g，瓊脂10～15 g，水500 mL，中性pH。

普通固體培養基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

滴棉蘭染色液：石炭酸10 g，加入乳酸、蒸餾水各10 mL，再加棉藍染色劑0.22 g。

1.3 菌種分離

取3份樣品茶葉分別標記為S1、S2、S3，每份樣品各取5 g，放置在盛有玻璃珠和95 mL無菌水的500 mL錐形瓶中，在溫度為28 ℃、轉速為180 r/min的搖床中恒溫震蕩培養20 min，取懸濁液為10-1液，并用無菌水進行濃度梯度稀釋，得到10-2～10-65個濃度梯度的菌液，每個梯度溶液取200 μL分別涂布于PDA固體培養基平板上，于28 ℃恒溫培養箱中培養。

1.4 菌種純化

從初次培養的培養皿中選出不同濃度下分離到的菌種，在超凈工作臺中將選出的培養皿中的單菌落進行挑取，接種到新的PDA培養基中重新劃線培養，直至分離出單一菌落。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 形態學觀察

對從茶湯中分離出的幾種不同的微生物做初步的形態學觀察。將分離純化后的菌株取出，在室溫下活化復蘇24 h后，分別接種于PDA固體培養基平板上，置于28 ℃培養箱中恒溫培養，隔天觀察菌落的生長狀況。

1.5.2 菌種的光學顯微鏡觀察

待接種的菌種生長至菌落直徑為1 cm時，取少量菌絲用棉蘭染色液染色5 min后于光學顯微鏡下觀察。

2 結果分析

2.1 菌種的分離純化

經過初期分離，從茶湯中提取出多種形態特征不一的微生物，并記錄初次培養7 d后的菌落生長狀況。

在初次分離的基礎上，選取長勢較好的菌落（S1：10-2、10-3、10-4；S2：10-4、10-5；S3：10-4），在超凈工作臺中將其接種在新的PDA固體培養基平板上，于28 ℃恒溫培養箱中培養5 d，培養后的觀察結果記錄如表1。

表1 菌落生長狀況記錄表

2.2 菌落的形態特征

如圖1所示，從二次培養的菌落中共分離得到4種不同形態的單一菌落。A為S1-1平板上分布的直徑為5～12 mm的圓形菌落，菌落較為致密，中心凸起部分為黃褐色，靠近邊緣為金黃色，邊緣部分為白色絨毛；B為S1-2平板上分布菌落直徑為1～2 mm的小型橙色圓形粘稠狀菌落；C為S1-3平板上長出的直徑為5 mm的單一乳白色粘稠狀圓形菌落；D為S2-2平板上菌落直徑為3～5 mm的圓形菌落，菌落較為致密，中心凸起部分為灰綠色，邊緣部分為白色絨毛。

圖1 二次培養中分離得到的4種不同形態的單一菌落

2.3 菌落的顯微特征

將S1-1和S2-2平板上的菌落經染色后用顯微鏡觀察。如圖2所示S1-1的分生孢子囊呈扁球形，菌絲較為疏松；S2-2的分生孢子囊殼為圓球形，菌絲較為致密。根據菌落特征及顯微特征判斷，這兩種菌落為冠突散囊菌。

圖2 菌落的顯微特征

3 討論

研究發現，黑茶中含有多種人體所需的氨基酸[6-7]，而“金花”的茂盛程度是決定茶品好壞的重要指標[8]。本次實驗將分離出的多種菌落進行多次分離純化培養，通過觀察菌株的培養特征和生理生化特征，發現其優勢真菌菌落有兩種形態，第一種菌落較大、呈現金黃色，成熟菌落中央凸起位置為黃褐色、邊緣為白色，菌落較為致密、表面布滿絨毛，顯微鏡下觀察菌體為扁球狀。另一種菌落較小、呈現綠色，成熟菌落中央凸起位置為深綠色、邊緣為白色，菌落致密，布有絨毛。這些菌落特征、顯微觀察結果與資料[1,9]中的結果相似，判斷為冠突散囊菌。后續將繼續對這兩種菌種進行分子鑒定，并進一步研究其生物活性及應用。