消毒劑脅迫對銅綠假單胞菌初期附著的可視化研究

杜邦，單蓉蓉，谷正

（合肥工業大學土木與水利工程學院，安徽合肥 230009）

余氯被廣泛用于飲用水的處理，但研究表明當細菌形成生物膜后，余氯對生物膜的消除能力會受到影響。一般來說，飲用水通常采用氯、氯胺、臭氧、碘和紫外線消毒等方式進行處理，且相關測試顯示銅綠假單胞菌等細菌對氯、氯胺、臭氧或碘不具有特異抗性。根據Fitzgerald等[1]的研究，在25 ℃時，氯含量為0.5 mg/L的游泳池需要1～3 h才能獲得99.9%的銅綠假單胞菌的殺滅率；而天然水需要1 h能夠殺死其中99.9%的銅綠假單胞菌。Xue等[2]的研究表明，氯的存在會使細胞膜和膜相關聚合物的化學官能團發生形變，阻止其可逆附著向不可逆附著的轉變，從而阻礙了生物膜在新的表面上的擴散和定植；而分泌藻酸鹽胞外聚合物較多的菌種，在余氯存在的情況下則具有更高的存活率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗所使用的菌種Pseudomonas aeruginosa（運動型，Wild-Type PAO1）和PAO1 ΔfliC（敲除鞭毛相關基因fliC的銅綠假單胞菌，非運動型變異株）由中國農業大學資源與環境學院實驗室提供。

試劑：LB培養基（奧博星，北京）；CDF緩沖溶液（Na2HPO40.54 g/L、KH2PO40.88 g/L、pH=6.98分析純，國藥集團，上海）；NaClO母液（分析純，國藥集團，上海）、SYTO 63（20 μmol/L Invitrogen,Thermo Fisher Scientific）。

儀器：LX-B50高溫滅菌鍋（華泰，合肥）；Eppendorf離心機（5810R，德國）；DNP-9162電熱恒溫培養箱（名宸，合肥）；Lambda 25/35/45分光光度計（PE，美國）；SK-O180-E水平搖床（大龍，北京）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（一恒，上海）；LSM710激光共聚焦顯微鏡（Zeiss，德國）。

1.2 實驗

以銅綠假單胞菌為例，確定細菌在不同濃度消毒劑脅迫下的初期附著情況。實驗選擇在無菌環境下的靜止系統中進行，選擇LB培養基作為營養來源，每個燒杯中營養條件一致。此外，設定一系列消毒劑的濃度梯度，消毒劑使用NaClO母液（上海國藥，分析純），在各反應器中添加一定量的NaClO母液，使各反應器環境中余氯濃度分別為0 mg/L（對照）、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L。另外，實驗過程均在超凈工作臺上進行，并封住杯口，避免雜菌污染。

實驗開始前，在每個燒杯中平放三片PE載片（長×寬×高=3.0 cm×1.0 cm×0.2 cm），并加入相應量的NaClO母液，搖勻后，分別將1 mL的兩種細菌菌懸液（已調整其OD600=0.5[3]）加入反應器中靜置培養并開始計時，20 min后取樣并進行相關指標的測定，每組實驗均設有3個平行樣，以保證實驗準確性。

1.3 生物膜的可視化觀察

載片取出后，使用生理鹽水緩慢沖洗，為了研究不同濃度消毒劑環境下細菌的附著情況，需要對細菌進行標記與染色。染劑使用SYTO 63[4]。

對細胞的形態進行觀察時，采用共聚焦激光顯微鏡LSM710與ZEN 2012 blue edition（Carl Zeiss Microscopy GmbH）軟件進行組合分析。樣品放置到激光共聚焦顯微鏡下，使用顯微鏡的40倍物鏡進行觀察，并用其中的Lambda-Z-stack對生物膜自上而下進行掃描，選取的視野區域尺寸為425 μm×425 μm，每個像素的尺寸是0.42 μm×0.42 μm×1 μm。使用ZEN軟件對每個環境中附著在載片上的生物膜圖像進行各個組分的拆分，得到各個組成成分在每一層上的圖像。

運用圖像中得到的信息，對生物膜上每一層被染色的面積進行統計，包括各個單獨成分與組合成分，對染色面積與染色面積的比例（進行計算與統計，可以得到總細胞在視野范圍內的體積，隨后計算出單位面積上的附著細菌體積，體積的計算方法如公式1所示：

其中，α為體積計算時插入的參數，本文中選取參數為1/2[5]；dZ為圖像每一層的厚度，為1 μm；a是Z-stack中選取的第一個界面；b是Z-stack中選取的最后一個界面，面積覆蓋率是每一層上染色面積在視野面積（425 μm×425 μm）上所占的比例，可經計算得到。

生物膜的厚度是研究生物膜結構和外觀的重要參數，一般方法是統計出每個x-y像素中熒光物質在z軸上的高度，進行統計可以得到每個像素中生物膜的厚度分布[6]。具體計算方法為：將面積覆蓋率進行統計，作出面積分布圖，x軸為面積分布率；y軸為Z-stack上的層數；0點對應的層數，為細菌總細胞數圖層上面積覆蓋率的峰值所在的層數，厚度的計算方法如公式2所示：

其中體積為公式1計算得出的該視野內物質的體積，面積分布律為該視野下某種物質（總細胞、多糖、蛋白質）的面積覆蓋率最大值。相關研究要求，以總細胞數的最大值所在的層數作為零點，繪制出生物膜中不同層數總細胞數的染色面積分布圖，蛋白質與多糖則以該零點所在層數為基礎，各自繪出各自成分的染色面積分布圖，用以比較該成分在生物膜中的所處的位置和分布。

2 結果與分析

2.1 附著細菌形成生物膜體積

激光共聚焦顯微鏡下生物膜形態如圖1所示。

培養20 min后，對細菌數量進行統計，結果如圖2所示。在初期附著階段，運動型細菌的附著量顯著高于非運動型細菌（t檢驗：P＜0.05），其平均附著量是非運動型細菌的1.22倍。

圖1 不同消毒劑濃度下的生物膜形態（使用激光共聚焦顯微鏡觀察）

消毒劑濃度對兩種細菌的附著數量影響比較顯著（單因素方差分析：P＜0.05）。隨著初始消毒劑濃度的上升，兩種細菌的附著量表現出了先增加后降低的現象，并且在1.0 mg/L的消毒劑環境中達到了峰值，運動型細菌為（13.13±0.29）μm3/μm2，而非運動型細菌為（10.16±0.58）μm3/μm2。

圖2 不同消毒劑濃度下生物膜的體積

2.2 生物膜平均厚度

為進一步觀察消毒劑的脅迫對生物膜形態形成的影響，對共聚焦激光顯微鏡所拍攝到圖像中生物膜的相關信息進行了進一步的分析，平均厚度的結果如圖3所示。對比兩種細菌的平均附著厚度可以發現，具有鞭毛結構的運動型細菌在附著過程中具有優勢，能夠形成更厚的生物膜（t檢驗：P＜0.05），這是由于鞭毛結構有利于細菌尋找合適的吸附位點，并增加附著率。

此外，消毒劑濃度對細菌的平均附著厚度影響比較顯著（單因素方差分析：P＜0.05）。隨著消毒劑濃度的上升，運動型細菌生物膜厚度從（13.79±1.15）μm上升至（16.14±4.10）μm，當消毒劑濃度上升至3.0 mg/L時，厚度下降至（11.69±1.15）μm，對于非運動細菌也發現了類似的規律，這說明中度的消毒劑濃度能促進銅綠假單胞菌形成更加致密的生物膜。

圖3 不同消毒劑濃度下生物膜的平均厚度

3 結論

（1）運動性能夠促進細菌初期的附著行為，具有鞭毛結構的細菌擁有更大的附著率，其附著體積與附著厚度都較非運動型細菌更大。

（2）消毒劑濃度對細菌的初期附著行為影響顯著，且適當濃度的消毒劑（1.0 mg/L）有利于促進細菌的附著行為，使生物膜生長得更加致密。