不同pH條件下陰溝腸桿菌ODC基因的表達調控研究

趙軒，范亞紅，劉利利，劉秀，葉竟雯，盛曉鈺，劉瓊馨

（1.長春師范大學生命科學學院，吉林長春130024；2.長春市九臺區營城第一高級中學，吉林長春130000）

陰溝腸桿菌為革蘭氏陰性細菌，廣泛存在于土壤中，是植物根系的聯合固氮菌。多項研究表明，聯合使用該菌具有降解農藥等環境污染物、提高農作物產量的作用[1-4]。

多胺參與細菌的多種應激反應[5-7]，相關研究表明細菌在酸性條件下，通過控制轉錄與翻譯過程誘導產生與多胺合成相關的酶，并進一步誘導產生多胺以適應酸性條件[8-9]。本研究在不同酸堿條件下培養陰溝腸桿菌，檢測不同條件培養液中腐胺含量及ODC基因的表達調控，為進一步分析陰溝腸桿菌產多胺機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

陰溝腸桿菌，由本實驗室篩選、保存。

1.2 試劑

ODC探針由北京鼎國生物技術有限公司合成，SYBR Green染料購自Thermo Fisher公司。

多胺液相檢測所需色譜級乙腈、甲醇購自美國Fisher公司；苯甲酰氯購自Aladdin試劑公司。

細菌培養液為ADF培養基。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌培養

（1）挑取單菌落于10 mL液體培養基中培養12～16 h。（2）吸取等量菌液接種于不同pH值的培養基中培養12～16 h。

1.3.2 樣品處理及液相檢測

收集不同培養條件下陰溝腸桿菌上清液，冷凍干燥后用5 mL超純水溶解，取2 mL溶解液加入20 μL苯甲酰氯衍生，衍生完畢后向溶液中加入1 g氯化鈉、2 mL乙醚漩渦震蕩，將乙醚層移至5 mL離心管中，用氮氣吹干后以甲醇溶解抽濾，進行液相色譜檢測。

1.3.3 定量PCR檢測不同pH條件下ODC基因的表達

提取細菌RNA反轉錄，以SYBR Green I熒光定量法分析ODC基因的表達變化，退火溫度為55℃，72℃收集熒光信號。

2 結果與分析

2.1 液相法檢測菌體上清液中腐胺含量

高效液相法檢測不同培養條件下上清液中腐胺含量，結果如圖1～2所示。在pH為5時上清液中無腐胺檢出，隨著pH值升高，陰溝腸桿菌上清液中腐胺含量升高，pH為8時約為0.25μg/μL，隨后上清液中腐胺含量降低，實驗3次重復，取平均值。圖1A為腐胺標品液相檢測，腐胺標品的保留時間為3.958，圖1B為不同pH條件下菌體上清液中腐胺分析結果。

圖1 陰溝腸桿菌腐胺液相檢測圖譜

圖2 不同pH培養條件下陰溝腸桿菌產腐胺含量變化

2.2 不同pH條件下ODC基因表達定量分析

以SYBR Green法通過定量PCR分析ODC基因的表達變化，實驗以16S rDNA為內參，以pH為7的樣品結果為對照，（本研究主要是探討在酸堿條件下多胺合成基因的表達變化，所以選擇中性條件為對照）以其他實驗組與對照組的比值為結果作圖，結果如圖3所示。在pH為8時，ODC基因表達量最高，結果與液相檢測一致。

圖3 不同pH條件下ODC基因表達調控變化

3 討論

本研究對不同酸堿條件下陰溝腸桿菌產腐胺情況及腐胺合成關鍵基因ODC的表達變化進行了研究分析。在pH為6和9時，腐胺含量下降，熒光定量分析不同pH條件下ODC基因的表達調控發現，在pH為8的偏堿條件下該基因表達量最高，這與液相檢測結果一致。多胺是細菌生長、分化及生殖的必需元素，在逆境條件下細菌通過多胺的表達調控度過不良環境[7-8]，本研究的結果表明陰溝腸桿菌在偏堿條件下ODC的表達升高，同時細菌上清液中腐胺含量最高，此結果說明腐胺合成變化可能是該菌適應堿性環境的主要原因，腐胺是精胺及亞精胺合成的主要底物，陰溝腸桿菌在偏堿條件下腐胺生成量升高，可進一步轉化為亞精胺及精胺[10]，進而通過其他環節調控幫助細菌度過不良環境。