膜分離技術(shù)純化蔓三七葉多糖的研究

李華勇，胡居吾

（1.江西省吉安市食品藥品檢驗檢測中心，江西吉安 343000；2.江西省科學院應用化學研究所，江西南昌 330096）

蔓三七，又名平臥菊三七，為多年生草本藥食兩用植物。蔓三七莖葉營養(yǎng)豐富，富含粗多糖和綠原酸等成分。民間利用其消炎止咳、通經(jīng)活絡、消腫止痛，可用于肺結(jié)核、支氣管肺炎等疾病的治療[1]。現(xiàn)代生物化學和醫(yī)學研究證明，蔓三七具有消炎止咳、散淤消腫[2]、提高人體免疫力[3]、降血糖、降血壓和抑制乙型肝炎等效果[4]。另一方面，蔓三七具有極好的營養(yǎng)價值，是一種藥食兼可的獨特植物，與木耳菜同屬。食味柔滑、清香可口，可清炒、涼拌、氽湯，其葉也可生吃，或取鮮葉開水沖泡當茶飲，是一種高經(jīng)濟價值的“藥食兩用”植物。

多糖具有復雜的化學結(jié)構(gòu)及豐富的生物活性，包括抗腫瘤[5]、抗炎[6]、抑制血管生成[7]、抗感染[8]、改善免疫功能[9]、調(diào)節(jié)血糖血脂[10]、保肝[11]等多種功效。

通過前期對蔓三七葉化學成分的研究，發(fā)現(xiàn)多糖類物質(zhì)為其主要成分之一，截至目前，關(guān)于蔓三七多糖的研究一直處于空白，嚴重制約了蔓三七這一植物的綜合利用。

傳統(tǒng)多糖提純方法（如鹽析法等）操作耗時、耗能，超濾技術(shù)借助化學、物理或能量等外力差異，以膜孔徑的大小進行液體中物質(zhì)的分離和純化[12]，不需要加熱或添加化學試劑，具有條件溫和、分離精度高、成本低、環(huán)保等特點，在植物多糖分離純化方面有著良好的應用前景[13]。

本研究以蔓三七葉為原料，對蔓三七葉多糖的工業(yè)化生產(chǎn)過濾工藝進行研究，目的是獲得蔓三七葉多糖生產(chǎn)相關(guān)超濾工藝參數(shù)，為促進蔓三七葉多糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔓三七葉由江西華紫仁農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，經(jīng)烘干、粉碎后過20目篩備用。無水葡萄糖，標準品，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；苯酚、硫酸均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

圖1所示為膜分離設備圖，浙江賽特膜技術(shù)有限公司生產(chǎn)；超濾膜，膜濾材質(zhì)為復合膜，膜面積1m2；UV-1800紫外可見分光光度計，日本島津儀器有限公司；METTLER-TOLEDOAL104型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q型超純水制備系統(tǒng)，美國Millipore公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DZF-6090Z型真空干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

圖1 膜分離系統(tǒng)試驗裝置圖

1.3 試驗方法

1.3.1 膜分離純化工藝流程

采用膜技術(shù)分離純化蔓三七多糖的工藝流程如圖2所示。

圖2 膜分離純化工藝流程

1.3.2 蔓三七葉粗多糖提取液工藝

取烘干、粉碎后的蔓三七葉，按料液比1∶15（g/mL）加入蒸餾水，于65℃恒溫水浴下提取2.5h，離心、抽濾，濾渣部分繼續(xù)用同樣方法浸提，上清液合并濃縮后緩慢加入4倍體積的無水乙醇沉淀粗多糖，于4 ℃下低溫靜置24 h，再以4800 r/min離心10 min，收集下層粗多糖沉淀，最后用無水乙醇洗滌2次，沉淀物用65℃超純水溶解，備用，用于超濾實驗[14]。

1.3.3 蔓三七葉提取液純化實驗

采用超濾膜主要去除蔓三七葉提取液中分子量較小的無機小分子等。其中，膜孔徑是影響膜分離中目標產(chǎn)物收率和含量大小的關(guān)鍵因素。通過研究蔓三七葉多糖分子量及組成，發(fā)現(xiàn)其分子量主要集中在1000KD以上。因此，選用截留分子量為1000KD的超濾膜進行試驗，并對超濾膜截留液和透過液濃縮、干燥。操作溫度和壓力對膜分離過程和膜通量有顯著的影響。因此，本試驗以固收率、蔓三七葉多糖含量和膜通量為性能指標，考察流量、溫度、時間和壓力對膜分離純化過程的影響。其中膜通量計算公式為：

式中，Q為膜通量，L/(min·m2)；V為超濾液體積，L；A為有效膜面積，m2；T為超濾時間，min。

1.3.4 超濾單因素試驗

以料液膜通量作為試驗指標，研究不同流量（15 mL/min、25 mL/min、35 mL/min、45 mL/min、55 mL/min）、不同溫度（10℃、20℃、30℃、40℃、50℃）、不同時間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）、不同壓力（50kPa、80kPa、110kPa、140kPa、170kPa）對超濾效果的影響。

1.3.5 超濾正交試驗設計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，考慮到過濾成本和產(chǎn)品質(zhì)量，固定料液流量為35mL/min，以操作溫度、時間和壓力為自變量，膜通量為試驗指標，對蔓三七葉多糖提取液的超濾工藝參數(shù)進行優(yōu)化，確定L9(34)的正交設計試驗，選用因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.3.6 超濾驗證

通過超濾工藝的單因素試驗及正交試驗分析結(jié)果確定蔓三七葉多糖生產(chǎn)中過濾工藝的最佳參數(shù)，依據(jù)最佳工藝參數(shù)進行蔓三七葉多糖提取液的超濾驗證，平行3份，測定蔓三七葉多糖的膜通量。

1.3.7 蔓三七葉多糖含量測定[14]

1.3.7.1 標準曲線的繪制

根據(jù)不同濃度的葡萄糖標準溶液及其對應的吸光度，得到苯酚-硫酸法的回歸方程為y=7.55x-0.078，R2=0.9994，表明總糖在0.021～0.166 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.7.2 粗多糖含量測定

精密稱取樣品10 mg，加超純水定容至25 mL，即得0.4 mg/mL的供試品溶液。取適量樣品溶液，平行3份，按1.3.7.1的操作方法測定樣品中的總糖含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用Origin 8.0軟件作圖，SPSS13.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾工藝條件的確定

2.1.1 流量對超濾效果的影響

流量對超濾效果的影響見圖3，蔓三七葉多糖提取液的膜通量隨著進料流量的增大呈先上升后下降的趨勢，在流量為35 mL/min時，蔓三七葉多糖提取液的膜通量最大，達0.88 L/(min·m2)。伴隨進料流量的繼續(xù)增大，蔓三七葉多糖提取液的膜通量有下降的趨勢。因為在增加料液的湍流程度同時，也可降低溶質(zhì)在膜層的濃度，減輕對凝膠層的影響。因此，考慮到超濾效率，選擇料液流量為35 mL/min。

圖3 流量對超濾效果的影響

2.1.2 溫度對超濾效果的影響

溫度對超濾效果的影響見圖4，蔓三七葉多糖提取液的膜通量隨溫度升高呈不斷上升的趨勢，在提取液的溫度為50℃時，蔓三七葉多糖提取液的膜通量最高，達為0.89 L/(min·m2)，比提取液的溫度為30℃時高了14.6%，比20℃高了37.07%。其原因是，由于提取液溫度的升高，料液粘度下降，流動性增強，膜通量也隨之變大。但是，當提取液溫度高于40℃，膜通量增加的速率逐漸變小，因為此時膜表面對大分子溶質(zhì)的吸附隨溫度升高而增加，致使凝膠層逐漸加厚，膜孔堵塞，導致超濾效果降低。因此，考慮到濾膜的使用壽命和超濾效果，確定提取液溫度為40℃。

圖4 溫度對超濾效果的影響

2.1.3 超濾時間對超濾效果的影響

超濾時間對超濾效果的影響見圖5，蔓三七葉多糖提取液的膜通量隨超濾時間延長而逐漸下降，超濾時間在5 min時，蔓三七葉多糖提取液的膜通量為0.90 L/(min·m2)；超濾時間在10 min時，蔓三七葉多糖提取液的膜通量為0.84 L/(min·m2)；超濾時間在15 min時，蔓三七葉多糖提取液的膜通量為0.71 L/(min·m2)；隨著超濾時間的進一步延長，膜通量下降逐漸加快，這是因為發(fā)生了濃度差極化，許多大分子溶質(zhì)會富集在膜表面，影響料液的超濾效率。因此，考慮到超濾效益，超濾時間定為10 min。

圖5 時間對超濾效果的影響

2.1.4 超濾壓力對超濾效果的影響

超濾壓力對超濾效果的影響見圖6，蔓三七葉多糖提取液的膜通量隨超濾壓力升高呈先上升后下降的趨勢。當超濾壓力為110 kPa時，蔓三七葉多糖提取液的膜通量最高，為0.86L/(min·m2)。在壓力小于110kPa時，增大超濾壓力，會增加膜分離過程中的推動力，使膜通量增大；當壓力超過110 kPa時，膜通量略有下降，是因為大分子溶質(zhì)在膜表面富集，凝膠層的厚度和密度相應增加，因而會影響超濾效率。因此，選擇壓力為110kPa。

圖6 壓力對超濾效果的影響

2.2 超濾正交分析

正交試驗設計及結(jié)果見表2，各超濾試驗因素對蔓三七葉多糖提取液的超濾效果的影響依次為超濾時間＞超濾壓力＞超濾溫度，且最佳組合為A3B1C1，即超濾溫度 45℃、超濾時間8min、超濾壓力90kPa。

表2 正交實驗設計及結(jié)果

正交試驗設計的方差分析見表3，各超濾試驗因素對超濾效果的影響是顯著的，說明該方程能很好地整合蔓三七葉多糖超濾的條件。因而最終確定的最佳超濾工藝參數(shù)為進料流量35 mL/min，超濾溫度45℃、超濾時間8min、超濾壓力90kPa。

表3 方差分析

2.3 超濾工藝驗證

由表4可知，在最佳超濾工藝條件下，蔓三七葉多糖膜通量為0.85L/(min·m2)，產(chǎn)品得率為10.0%，產(chǎn)品純度為80.9%，重現(xiàn)性良好。

表4 超濾工藝驗證

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗確定蔓三七葉多糖的最優(yōu)超濾工藝條件為進料流量35 mL/min，超濾溫度45℃、超濾時間8min、超濾壓力90kPa。蔓三七葉多糖膜通量可過0.85 L/(min·m2)，產(chǎn)品得率為10.0%，產(chǎn)品純度為80.9%。