青海西寧牦牛病毒性腹瀉疫病病原學調查與分析

楊秀玲,李志強,羅永珍,蘆光花

(1.青海省湟源縣城關鎮畜牧獸醫站，青海 湟源 812199；2.青海省湟中縣上五莊鎮畜牧獸醫工作站，青海 湟中 811600；3.青海省湟源縣東峽鄉畜牧獸醫站，青海 湟源 812100；4.青海省湟中縣畜牧獸醫站，青海 湟中 811600)

牦牛為我國特有珍稀牛種之一，分布于青藏高原，是我國藏族人民衣食住行燒耕的主要來源，近年來隨著我國對特種動物養殖扶持政策的不斷完善，各種補助的不斷提高，牦牛的規?；犸曫B殖得到了快速與盲目發展，但由于舍飼養殖導致了牦牛生活習性的改變，致使牦牛腹瀉性疫病增多，影響了牦牛產業的穩定發展。引起牦牛腹瀉的原因較多，主要包括營養性腹瀉、細菌感染、病毒感染以及寄生蟲感染等，其中以病毒性腹瀉的危害最為嚴重。而引起牦牛病毒性腹瀉的致病原主要有牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛腸道病毒(BEV)、牛冠狀病毒(BCV)和牛星狀病毒(BAstV)[1-5]。為全面掌握青海省西寧市牦牛群中病毒性腹瀉各種致病原的感染現狀，本試驗采用RT-PCR方法首次對2017年采集于西寧市下屬6各縣的74份具有腹瀉癥狀的牦牛糞便樣品進行了BVDV、BRV、BEV、BCV和BAstV的核酸檢測，并對檢測結果進行了單獨感染與混合感染的統計與分析，為西寧市牦牛腹瀉性疫病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2017年共采集青海省西寧市城東區、城西區、城北區、湟源縣、湟中縣、大通縣等部分地區牦牛養殖場和散養戶中具有明顯腹瀉癥狀的牦牛新鮮糞便樣品共計74份。

1.2 主要試劑與試劑盒 病毒基因組RNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；一步法RT-PCR擴增試劑盒、DL-2 000 DNA Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 檢測樣品的處理 將采集的新鮮糞便樣品加入3倍體積滅菌生理鹽水中，碾磨、反復凍融3次，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液即得處理后的檢測樣品，-20 ℃保存備用。

1.4 樣品基因組RNA的提取 利用病毒基因組RNA提取試劑盒分別提取74份腹瀉牦牛檢測樣品的病毒基因組RNA。

1.5 引物設計與合成 分別根據參考文獻[5]、[6]、[7]設計,針對BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的特異性檢測引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。

表1 引物信息

1.6 RT-PCR擴增 以提取的74份牦牛腹瀉樣品的基因組RNA為模板，分別利用合成的BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV特異性檢測引物進行RT-PCR擴增(RT-PCR擴增信息見表2)，RT-PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

表2 RT-PCR擴增信息

1.7 感染情況統計分析 對74份牦牛腹瀉樣品的BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV檢測結果進行統計，分析5種致病原的單獨感染與混合感染情況。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR檢測結果 采用RT-PCR方法分別對西寧市下屬6個縣市的74份腹瀉牦牛樣品進行了BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的病原學檢測，結果如表3所示，共檢測出BVDV陽性樣品28份(部分樣品電泳圖如圖1所示)，平均陽性率為37.84%，6個縣市均存在BVDV感染，以湟源縣的陽性感染率最高，達47.62%。共檢測出BRV陽性樣品20份(部分樣品電泳圖如圖2所示)，平均陽性率為27.03%，除城西區以外的5個縣市均存在BRV感染，以湟源縣的陽性感染率最高，達38.10%。共檢測出BEV陽性樣品17份(部分樣品電泳圖如圖3所示)，平均陽性率為22.97%，6個縣市均存在BEV感染，以湟源縣的陽性感染率最高，達28.57%。共檢測出BCV陽性樣品4份(部分樣品電泳圖如圖4所示)，平均陽性率為5.41%，感染區域主要集中在湟源縣、湟中縣、大通縣，以湟源縣的陽性感染率最高，達9.52%。共檢測出BAstV陽性樣品2份(部分樣品電泳圖如圖5所示)，平均陽性率為2.70%，感染區域主要集中在湟源縣和湟中縣，感染率分別為4.76%和6.25%。該結果表明，西寧市大部分地區均存在BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的流行，其中以湟源縣的流行最為嚴重。而引起西寧市牦牛病毒性腹瀉的主要致病原為BVDV、BRV、BEV，其中以BVDV的感染最為嚴重。

表3 不同地區的檢測結果

圖1 部分樣品BVDV RT-PCR擴增結果

M ： DL-2 000 DNA Marker；2、3、5、7 ：陽性樣品；1、4、6、8：陰性樣品

圖2 部分樣品BRV RT-PCR擴增結果

M ： DL-2 000 DNA Marker；2、3、6 ： 陽性樣品；1、4、5、7：陰性樣品

圖3 部分樣品BEV RT-PCR擴增結果

M：DL-2 000 DNA Marker；2、3、5、7：陽性樣品；1、4、6、8：陰性樣品

圖4 部分樣品BCV RT-PCR擴增結果

M:DL-2 000 DNA Marker；1、2:陽性樣品； 3、4、5、6:陰性樣品

圖5 部分樣品BAstV RT-PCR擴增結果

M:DL-2 000 DNA Marker；2:陽性樣品； 1、3、4、5、6、7:陰性樣品

2.2 單獨感染與混合感染的統計分析 對74份牦牛腹瀉樣品的檢測結果進行BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV 5種致病原單獨感染與混合感染的統計與分析，結果如表4所示，在單獨感染方面，共存在BVDV、BRV、BEV、BAstV 4種致病原的單獨感染，其中以BVDV的單獨感染率最高，達16.22%。在混合感染方面，共存在BVDV/BRV、BVDV/BEV、BVDV/BCV、BRV/BEV、BRV/BCV、BVDV/BRV/BEV、BVDV/BRV/BCV 7種混感型，其中以BVDV/BEV和BVDV/BRV的混合感染較嚴重，混感率分別達8.11%和6.76%。該結果表明，引起西寧市牦牛病毒性腹瀉的原因主要有BVDV、BRV、BEV、BAstV 4種致病原的單獨感染以及BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV 5種致病原的混合感染，且混合感染型較多，混合感染情況較復雜、較嚴重。

表4 單獨感染與混合感染的統計分析

3 討論

近年來，隨著牦牛養殖產業的快速發展，牦牛病毒性腹瀉疾病的發生率也逐漸增多，逐步引起我國研究學者的重視，開展了大量的牦牛病毒性腹瀉疾病相關致病原的流行病學調查。陳新諾等[8]采用RT-PCR方法對四川和西藏部分高原地區采集的149份臨床腹瀉牦牛糞便樣品進行了BVDV的檢測，BVDV陽性檢出率為19.46%，其中西藏地區牦牛BVDV陽性檢出率為27.14%，四川地區牦牛BVDV陽性檢出率為12.66%。陳新諾等[9]應用RT-PCR對青藏高原地區(西藏、青海、四川和云南)共計222份出現腹瀉癥狀的牦牛糞便樣品進行了BVDV和BEV的病原學檢測，BVDV陽性檢出率為20%，BEV陽性檢出率為29.4%，BVDV/BEV混合感染陽性率為4.8%。柳清[10]采用ELISA試劑盒對青海省6個規模牦牛飼養場和11戶散養戶的559份血清樣品進行了BVDV抗體檢測，BVDV平均陽性率為36.14%，規模牦牛場平均陽性率為34.19%，散養戶平均陽性率為39.42%。戴源森等[11]采用ELISA抗體檢測法和RT-PCR抗原檢測法對青海省海北州門源縣及周邊縣的712份牦牛血清樣品進行了BVDV抗體與抗原的檢測，BVDV抗體平均陽性率為21.21%，BVDV抗原平均陽性率為22.19%。權英存等[12]采用RT-PCR方法對青海省部分地區的32份具有腹瀉癥狀的臨床病料進行了BVDV、BRV、BCV的核酸檢測與分析，BVDV、BRV、BCV的陽性率分別為65.63%、18.75%、34.38%。為豐富西寧市牦牛病毒性腹瀉疾病致病原的流行病學資料，本試驗于2017年在西寧市境內共采集了牦牛規模養殖場和散養戶的腹瀉牦牛樣品74份，采用RT-PCR方法分別對其進行了BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV 5種致病原的病原學檢測與分析，結果顯示，BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV平均陽性感染率分別為37.84%、27.03%、22.97%、5.41%、2.70%，表明西寧市大部分地區均存在BVDV、BRV、BEV、BCV、BAstV的流行，以BVDV、BRV、BEV的感染較為嚴重，其中本試驗中西寧市腹瀉牦牛BVDV感染率略高于陳新諾等[8-9]調查的四川和西藏、青海和云南地區以及戴源森等[11]調查的青海省海北州門源縣，略低于權英存等[12]調查的青海省部分地區。同時本試驗發現西寧市腹瀉牦牛群中存在多種致病原的混合感染，且混合感染型較多，混合感染情況較復雜、較嚴重，混合感染不但增加了疫病的診斷難度，同時對牛群造成的危害和經濟損失更加嚴重，應加強重視。筆者呼吁加強對牦牛病毒性腹瀉疫病的重視，加強對致病原的監測，對感染牦牛應及早淘汰和無害化處理，逐步建立和維護無病牛群，保障青海牦牛養殖業的快速與健康發展。