樹突狀細胞疫苗在惡性膠質瘤免疫治療中的應用

劉鴻宇 沈少平 楊霖 余新光 陳凌

膠質瘤是中樞神經系統最為常見的惡性腫瘤，在中國人群中的年發病率為5～7/10萬，且呈上升趨勢。膠質瘤占全部中樞神經系統腫瘤的26%，占顱內惡性腫瘤的81%，其中惡性程度最高的類型為膠質母細胞瘤（WHOⅣ級），占全部膠質瘤的56.6%；中樞神經系統惡性腫瘤患者平均5年生存率為35%，而膠質母細胞瘤患者5年生存率低于6%［1］。膠質母細胞瘤發病率高、生存率低，是嚴重危及生命的重大疾病。目前標準治療方案以手術切除為主輔以放射治療和藥物化療等多種方式的綜合治療［2］，但復發率仍較高，其中位生存期僅為14.6個月［3］。膠質母細胞瘤的治療困境促使臨床醫師和科研人員努力尋求新的治療方法［4?6］。既往數十年，隨著對免疫系統認識的不斷深入，研究者對其在腫瘤發生發展中的作用產生了濃厚興趣［7］，許多新的治療方法聚焦于腫瘤免疫治療［8?12］。

腫瘤免疫治療的本質是腫瘤與免疫系統之間的博弈過程，這一過程早在2004年即由Dunn等［13］進行系統總結，提出“3Es假說”，即免疫細胞和腫瘤細胞在消滅（Elimination）、平衡（Equilibrium）和逃逸（Escape）中不斷斗爭，腫瘤細胞內源性或外源性因素參與其中，發揮對抗免疫系統的作用。但是對于惡性膠質瘤而言，腫瘤內源性抵抗和適應性抵抗均發揮較強作用，包括免疫抑制因子分泌和免疫檢查點分子過表達［14?19］、人類白細胞抗原（HLA）水平降低［20］、調節性 T 細胞（Treg）數目增加［21?23］等，導致與其他腫瘤相比，免疫治療難度更大。目前僅有不足10%的膠質瘤患者對免疫治療產生反應。對膠質瘤而言，有效的免疫治療不僅要打破免疫耐受，產生對腫瘤抗原的免疫應答，而且還要克服不斷出現的一系列適應性和獲得性免疫逃逸機制。免疫治療通過免疫系統，特別是獲得性免疫系統特異性攻擊腫瘤，樹突狀細胞（DC）作為專職抗原呈遞細胞（APC），在固有免疫和適應性免疫中均發揮重要作用，因此樹突狀細胞疫苗在免疫治療中也占據一席之地，可以作為針對各種腫瘤的有希望的免疫治療方法［9］，在膠質母細胞瘤及其他高級別膠質瘤的治療中也受到越來越多的關注。

一、樹突狀細胞疫苗的作用原理

樹突狀細胞源于骨髓淋巴細胞，可定居在全身組織，對周圍環境進行監視，并隨時將捕獲的信息傳送至適應性免疫系統［T淋巴細胞（以下簡稱T細胞）和B淋巴細胞（以下簡稱B細胞）］，是表達主要組織相容性復合物（MHC）Ⅰ和Ⅱ類分子的專職抗原呈遞細胞，是固有免疫和適應性免疫的關鍵關聯紐帶［24］。樹突狀細胞將從外周獲取的抗原內化分解為短肽段，以肽段?MHC復合物形式表達于樹突狀細胞表面，這一過程也是樹突狀細胞成熟的過程，然后載有抗原肽的樹突狀細胞遷移至二級淋巴器官，在此激活T細胞［25］。與其他抗原呈遞細胞相比，樹突狀細胞抗原提呈效率極高，且可誘導極少數T細胞應答，成為T細胞和B細胞反應最有效的內源性刺激［26?27］。

動物模型業已證實，腫瘤周圍樹突狀細胞可以捕獲腫瘤細胞釋放的腫瘤抗原，這些抗原來源于死亡的腫瘤細胞或通過樹突狀細胞吞噬活的腫瘤細胞，再將這些抗原交叉提呈給腫瘤以引流淋巴結內T細胞，從而誘導腫瘤抗原特異性細胞毒性T細胞（CTL）的產生，殺傷腫瘤細胞［28?29］。在這一過程中，腫瘤細胞與樹突狀細胞相互制衡，一方面，死亡的腫瘤細胞釋放信號如溶血磷脂酰膽堿（LPC）、1?磷酸鞘氨醇（S1P）等，使樹突狀細胞發現死亡的腫瘤細胞并促進其吞噬死亡細胞；同時，腫瘤細胞也釋放一些信號，如CD47、乳鐵蛋白等，阻礙樹突狀細胞對腫瘤的吞噬作用。上述因素均是影響樹突狀細胞疫苗的重要因素。

二、樹突狀細胞在惡性膠質瘤微環境中的地位

正常腦實質中通常不存在樹突狀細胞，而主要存在于富含血管部位，如脈絡膜、腦膜等，提示外周循環中樹突狀細胞具備轉移至中樞神經系統的潛力，但其在膠質瘤中的作用尚待進一步闡明。目前研究顯示，在膠質瘤局部免疫微環境中，樹突狀細胞、小膠質細胞、巨噬細胞、T細胞和腫瘤細胞之間的相互作用十分復雜，已發現的可能作用機制是：樹突狀細胞在腫瘤局部捕獲腫瘤抗原，并轉移至頸深淋巴結，激活后續免疫應答，同時在腫瘤局部產生趨化因子如CC趨化因子配體9和10（CCL9和CCL10），以募集活化的淋巴細胞至腫瘤局部，最后在某些細胞因子如局部T細胞和自然殺傷（NK）細胞分泌的干擾素?γ（IFN?γ）作用下，樹突狀細胞可以產生細胞因子如白細胞介素?12（IL?12），進一步提升免疫細胞的抗腫瘤活性。然而在臨床實踐中，由于膠質瘤的整體免疫抑制大環境和腫瘤局部免疫微環境中多種細胞相互作用，使得樹突狀細胞無法順利完成免疫應答，而且在腫瘤微環境中腫瘤細胞表達分泌的多種分子可以抑制樹突狀細胞活化并驅使樹突狀細胞向抑制型或調節型表型轉化，抑制腫瘤的免疫應答。因此，盡管對樹突狀細胞的了解正在逐步完善，但其在膠質瘤微環境中的作用及其機制仍有待進一步探索。

三、樹突狀細胞疫苗在惡性膠質瘤中的臨床試驗

鑒于樹突狀細胞在固有免疫和適應性免疫中的關鍵作用，以及臨床前研究結果顯示的樹突狀細胞疫苗可以成功誘導抗腫瘤免疫反應，相關臨床試驗正逐步開展并初見成效。2010年，美國食品與藥品管理局（FDA）批準首個樹突狀細胞疫苗Provenge用于治療難治性前列腺癌［30］；此后，相繼在乳腺癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌和直腸癌、肺癌、黑色素瘤的治療中取得一定療效［31］。上述這些在臨床所取得的初步成果，目前均為高級別膠質瘤樹突狀細胞疫苗臨床試驗的基礎［32?64］。

最早應用樹突狀細胞疫苗治療高級別膠質瘤的兩項臨床試驗發表于2001年。Kikuchi等［32］將手術切除的腫瘤組織先行處理，獲得自體膠質瘤細胞后用X線照射，然后將經過處理的自體膠質瘤細胞作為抗原致敏樹突狀細胞，回輸至8例復發高級別膠質瘤患者體內，其中2例達到部分緩解，但該項研究并未報道其生存期。Yu等［33］對9例新發高級別膠質瘤患者（新發膠質母細胞瘤7例、間變性星形膠質瘤2例）接種以自體腫瘤細胞表面肽為抗原的樹突狀細胞疫苗，同時選擇42例同期接受相同手術的高級別膠質瘤患者作為對照，結果顯示，疫苗接種組患者外周循環和腫瘤局部均產生大量細胞毒性物質，生存分析提示，與對照組相比，疫苗接種組患者中位總生存期（OS）從257天增至455天。初步試驗的良好療效促使一系列樹突狀細胞疫苗治療高級別膠質瘤的Ⅰ期試驗不斷涌現［34?47］，以評價其有效性和安全性。Rutkowski等［37］以12例經標準方案治療后復發的膠質母細胞瘤患者作為觀察對象，每2～4周接種1次樹突狀細胞疫苗，平均治療5次（2～7次）后評價治療的有效性和安全性，僅1例注射疫苗前有明顯殘留腫瘤的患者治療過程中反復出現治療相關瘤周水腫，4例出現輕微不良反應，無一例發生嚴重不良反應；在腫瘤部分切除患者中，1例病情穩定、1例腫瘤體積縮小50%，腫瘤全切除患者中2例生存期分別為35和36個月。Yamanaka等［34］的臨床試驗顯示，經樹突狀細胞疫苗治療的膠質瘤患者部分瘤內淋巴細胞浸潤增多。Liau等［39］采用樹突狀細胞疫苗共治療12例膠質母細胞瘤患者，治療后腫瘤局部CD3+T細胞數目均明顯增加，1例影像學檢查顯示腫瘤體積明顯縮小，6例外周血抗腫瘤CTL細胞數目明顯增加，余未見明顯免疫應答，但外周血效應性T細胞（Teff）數目增加與生存期并無顯著關聯性；其中8例經歷再次手術，4例瘤內CTL細胞數目增加，而瘤內Teff細胞數目增加與生存期呈正相關。Yamanaka等［40］完成的Ⅰ期/Ⅱ期試驗是迄今納入病例數最多的初期臨床試驗，24例高級別膠質瘤患者（WHOⅢ級6例、WHOⅣ級18例）均對現有標準治療方案耐藥，皮下注射或皮下聯合瘤內注射樹突狀細胞疫苗，僅出現注射部位紅腫，未見其他不良反應；中位總生存期增至480天，進一步研究顯示，T細胞活性與總生存期延長呈正相關。

盡管Ⅰ期臨床試驗結果令人鼓舞，但是由于大部分研究所納入的病例數較少，臨床療效的可靠證據并不強，僅能說明樹突狀細胞疫苗安全可行，有初步效果。在此基礎上，大樣本的Ⅱ期/Ⅲ期臨床試驗逐漸開展。2008 年，De Vleeschouwer等［42］率先完成早期較大規模的Ⅱ期臨床試驗，共納入56例復發膠質母細胞瘤患者，以腫瘤細胞裂解物致敏樹突狀細胞疫苗輔助注射腫瘤細胞裂解物，并根據治療頻率進行分組，雖然生存率未見明顯提高，但亞組分析提示，每周接種疫苗的患者可獲得生存期延長。2018年，Liau等［64］公布以自體腫瘤細胞裂解物致敏樹突狀細胞疫苗DCVax?L聯合替莫唑胺化療治療新發膠質母細胞瘤的Ⅲ期臨床試驗的中期結果，331例患者均隨訪至腫瘤復發，所有患者均予DCVax?L治療，中位總生存期為術后23.1個月，其中223例術后總生存期＞30個月、182例術后總生存期＞36個月；進一步根據O6?甲基鳥嘌呤?DNA甲基轉移酶（MGMT）突變進行分層分析顯示，MGMT突變患者（131例）中位總生存期為34.7個月，其中100例達40.5個月，但未探究預后相關影響因素；僅2.11%（7/331）患者出現3或4級不良事件［美國國立癌癥研究所（NCI）通用毒性標準（CTC）］，包括腦水腫3例、癲發作2例、惡心1例、淋巴結感染1例，推測可能與接種疫苗有關。該項研究的Ⅲ期試驗結果顯示出良好的應用前景，表明樹突狀細胞疫苗可使患者獲得顯著的生存獲益。2019年，Wen等［65］報告其最新樹突狀細胞疫苗ICT?107治療新發膠質瘤母細胞瘤的Ⅱ期臨床試驗結果，并評價其有效性和安全性以及對生存獲益和誘導免疫反應的影響。ICT?107是靶向6個特異性抗原的自體樹突狀細胞疫苗，分別為人類白細胞抗原A1（HLA?A1）限制性MAGE?1、AIM?2以及HLA?A2限制性人表皮生長因子受體2（HER2）、TRP?2、gp100、IL?I3Rα2，上述6 個抗原在83%腫瘤細胞中全部表達。疫苗接種組納入81例膠質母細胞瘤患者，對照組納入43例膠質母細胞瘤患者，疫苗接種方案為放化療后4周為誘導期（注射疫苗1次/周），隨后為維持期（替莫唑胺治療第1、3、6、10個療程的第21天注射疫苗1次，以及藥物化療結束后每6個月注射1次，直至試驗結束）。結果顯示，疫苗接種組患者最常見的不良事件為乏力、嘔吐、眩暈，與對照組相比無顯著差異；生存分析提示，兩組患者總生存期差異無統計學意義（17個月對15個月，P=0.580），而疫苗接種組無進展生存期（PFS）優于對照組（11.2個月對9個月，P=0.011）；亞組分析顯示，僅在 HLA?A1陽性伴MGMT啟動子區甲基化患者中，疫苗接種組總生存期優于對照組（47.6個月對25.8個月，P=0.049），表明該多靶點疫苗既可改善膠質母細胞瘤免疫抑制微環境，又能在一定程度上克服腫瘤異質性。

但并非所有的臨床試驗均顯示樹突狀細胞疫苗可使膠質母細胞瘤患者生存獲益。Walker等［43］的Ⅰ期臨床試驗納入9例膠質母細胞瘤患者和4例間變性星形細胞瘤患者，予樹突狀細胞疫苗聯合膠質瘤標準治療，再次手術后腫瘤標本中T細胞浸潤增多，但總生存期并無明顯延長。因此，可能尚有其他因素影響治療效果，這些均需積累更多的數據或探索更優的治療方案以達到更穩定的療效。

四、樹突狀細胞疫苗在膠質瘤治療中的前景展望

樹突狀細胞疫苗的療效和相對安全性引起了研究者對這種新療法的極大興趣。目前已發表的11項樹突狀細胞疫苗治療新發高級別膠質瘤的臨床試驗中7項表現出生存獲益，但是評價樹突狀細胞疫苗治療復發高級別膠質瘤效果的臨床試驗中僅有不足20%的患者生存獲益，究其原因是所納入的病例數較少而無法得出明確結論。臨床應用樹突狀細胞疫苗存在諸多困境與挑戰，如疫苗來源、疫苗抗原和佐劑選擇、疫苗靶向優化、遷移性限制、聯合治療等，均有待進一步深入研究。

1.疫苗來源 目前，體外制備可應用于臨床的樹突狀細胞疫苗大多通過自體血分離CD14+單核細胞誘導而來，但存在制備時間長、細胞數目有限、制備過程繁瑣、費用高昂等問題。由此可見，解決疫苗來源是最根本問題。晚近有研究者通過誘導型多能干細胞（iPSCs）、增殖型髓系細胞等誘導抗原呈遞細胞，可以制備大量樹突狀細胞樣細胞，與骨髓來源樹突狀細胞功能、表型等一致，可能有望解決樹突狀細胞疫苗來源的問題。

2.疫苗抗原和佐劑的選擇 目前，構建樹突狀細胞疫苗的抗原多為腫瘤相關抗原（TAA）或腫瘤細胞裂解物，其優點是制備簡便且有一定療效；此外，腫瘤細胞來源外泌體作為腫瘤抗原也備受關注。外泌體是細胞分泌至細胞外環境的一種小囊泡，含有許多抗原提呈所必需的分子，如特異性抗原、MHCⅠ和Ⅱ、共刺激分子和細胞間黏附分子（ICAM）［66］。腫瘤細胞來源外泌體顯示出許多優于傳統抗原的特性，包括對腫瘤免疫微環境的抵抗、強大的抗原提呈表型、將抗原從專業抗原呈遞細胞轉移至其他抗原呈遞細胞的能力，并能夠長期保存。2017年，Liu等［66］在膠質瘤小鼠模型中發現，以外泌體致敏的樹突狀細胞疫苗具有更強的抗腫瘤細胞毒性作用。除優化疫苗抗原外，聯合佐劑治療也可以增強療效，不僅可以激活樹突狀細胞，還可以激活免疫系統的多個分支，從而對抗腫瘤的免疫逃逸機制，增強樹突狀細胞介導的免疫治療。臨床前研究證實有一種細胞佐劑有較好的應用前景，即自然殺傷T細胞（NKT）。NKT細胞不僅具有直接攻擊腫瘤細胞的能力，而且可通過分泌輔助性T細胞1和2（Th1和Th2）調節T細胞活性，通過CD40L/CD40介導的相互作用促進樹突狀細胞成熟［67?69］。其另一個優勢在于對膠質母細胞瘤微環境的抗腫瘤免疫調節作用，包括激活免疫細胞（如B細胞、T細胞和樹突狀細胞），以及下調和殺傷腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和骨髓來源抑 制細胞（MDSC）［66，70?72］。此外，NKT細胞與樹突狀細胞之間的協同作用可以增強CD4+和CD8+T細胞活性，在誘導強而持久的免疫應答中非常有效［70］。Liu 等［66］通過腫瘤細胞來源外泌體聯合恒定自然殺傷T細胞（iNKT）佐劑構建的樹突狀細胞疫苗在小鼠原位膠質瘤模型中驗證了這一點，經治療后小鼠存活期明顯延長，表明組合療法可以導致針對膠質瘤的協同細胞毒性抗腫瘤效應。

3.遷移限制 樹突狀細胞疫苗應用過程中面臨的另一棘手問題是疫苗遷移。研究顯示，僅不足5%的樹突狀細胞疫苗可遷移至淋巴結［73］，因此，改善樹突狀細胞淋巴結歸巢是提高腫瘤抗原特異性樹突狀細胞療效的重要方法［60］。Mitchell等［60］將 Td類毒素作為一種有效抗原，對膠質母細胞瘤患者的疫苗接種點進行預處理，使樹突狀細胞遷移增強，生存率顯著提高。體內靶向樹突狀細胞的研究也顯示出克服樹突狀細胞遷移能力較差的缺點［74］。樹突狀細胞疫苗的體內接種方法主要是單克隆抗體靶向特異性細胞表面受體。CD205是介導抗原攝取和提呈的新受體，對黑色素瘤小鼠模型的觀察顯示，注射抗CD205抗體耦聯的腫瘤抗原可以刺激小鼠體內CD4+和CD8+T細胞的增殖活化，延緩腫瘤生長［75］。Dhodapkar等［76］的人抗 CD205 抗體與腫瘤抗原NY?ESO?1相結合致敏樹突狀細胞疫苗的研究也證實人體內治療的可行性。涉及單克隆抗體介導的膠質母細胞瘤抗原向樹突狀細胞傳遞的體內靶向方法尚待進一步研究，值得期待。

4.聯合治療 為提高樹突狀細胞疫苗的療效，多種免疫治療方法的聯合應用不失為更有效的策略。免疫檢查點抑制劑在改善惡性腫瘤患者預后方面業已取得矚目成就［77?80］。盡管單純免疫檢查點抑制劑治療惡性膠質瘤的研究結果并不樂觀，已有Ⅲ期臨床試驗（CheckMate?143）證實其延長生存期的作用并不優于貝伐單抗，但與樹突狀細胞疫苗聯合應用的療效可能有所不同，樹突狀細胞疫苗可以增加腫瘤局部浸潤T細胞數目，免疫檢查點抑制劑可以減少腫瘤局部T細胞耗竭，二者結合使治療效果更佳。Keskin等［81］研究發現，個體化樹突狀細胞疫苗可以增強膠質母細胞瘤新抗原特異性CD4+和CD8+T細胞免疫應答，使腫瘤局部浸潤的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）數目增加。Garris等［82］的研究也證實免疫檢查點抑制劑發揮作用需腫瘤局部樹突狀細胞與T細胞相互作用。關于二者聯合應用的臨床試驗目前正在進行中，國內也有研究團隊開展了這一聯合治療方法的臨床試驗（試驗編號：ChiCTR1900025835）。

通過優化樹突狀細胞的靶向和抗原負載、克服遷移性限制、結合其他免疫治療方法等以改善腫瘤免疫抑制微環境，有助于提高樹突狀細胞疫苗治療膠質母細胞瘤的療效，有可能在Ⅲ期臨床試驗中取得有希望的結果，成為重要的臨床治療方法。

五、小結

樹突狀細胞在固有免疫和獲得性免疫系統中發揮重要作用，在膠質母細胞瘤微環境中具有復雜的免疫功能。臨床前研究和臨床試驗業已顯示出樹突狀細胞疫苗可以增強免疫應答并延長患者總生存期。各種協同佐劑的組合旨在克服膠質瘤誘導的免疫抑制，樹突狀細胞疫苗治療新發膠質母細胞瘤患者的Ⅲ期臨床試驗中期結果證實其有效性、安全性和可行性。尚待進一步探討基于此免疫療法的最佳組合，從而使患者有最大獲益。隨著對膠質母細胞瘤免疫基因組學和腫瘤逃逸途徑的不斷了解，使基于樹突狀細胞疫苗的免疫療法不斷完善，有助于使基于主動免疫的特異性腫瘤治療成為可能。

利益沖突無