核酸適配體在肺腺癌診斷和治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀及研究進(jìn)展

李名一，姜良勇，高 川，劉媛媛

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154004；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

20世紀(jì)末，單克隆抗體(mAb)技術(shù)的出現(xiàn)給醫(yī)學(xué)攻克癌癥帶來(lái)了希望。但是它并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果，之后隨及出現(xiàn)了一種使生物分子特異性結(jié)合的技術(shù)，它就是我們現(xiàn)在所熟知的適配體，aptamer(適配體)來(lái)源于拉丁語(yǔ)“aptus”，意思是“西服”，希臘語(yǔ)后綴“meros”意為“部分”，這說(shuō)明適配體具有與特定目標(biāo)進(jìn)行互動(dòng)的潛力。是最早由Ellington等[1]和Tuerk等在1990年提出，核酸適配體是從一種人工合成的寡核苷酸文庫(kù)中篩選得到單鏈寡核苷酸， 可以是單鏈 DNA， 也可以是RNA[2]。分子量約為10 ～ 30 kDa，明顯小于抗體。DNA相對(duì)而言，它在體外會(huì)更穩(wěn)定。可以通過(guò)三維互補(bǔ)，不是堿基配對(duì)，來(lái)識(shí)別目標(biāo)，并與目標(biāo)結(jié)合，特異性和親和力高，有或幾乎沒(méi)有免疫原性，不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)[3]。同樣它們也被叫做"核酸抗體"。迄今為止，適配體已經(jīng)應(yīng)用于很多的生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，從生物成像、疾病診斷、靶向治療以及給藥。它們?cè)谂R床和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中顯示出非常大的潛力。它是一種短小的單鏈寡核苷酸，可以折疊成獨(dú)特的3D結(jié)構(gòu)。適配體，它是通過(guò)一種被稱(chēng)為"指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化"(SELEX)技術(shù)篩選出來(lái)的。這種Cell-SELEX技術(shù)篩選的靶標(biāo)有癌細(xì)胞，正常細(xì)胞和炎癥細(xì)胞等，器官和組織也有很多，有腦、肺、肝、胰腺、乳腺和卵巢等。其中SELEX主要包括毛細(xì)管電泳-SELEX (CE-SELEX)、細(xì)胞SELEX、快速SELEX。Cell-SELEX的主要優(yōu)勢(shì)在于，與以前的SELEX技術(shù)相比，Cell-SELEX的選擇過(guò)程可以在不需要靶蛋白基礎(chǔ)上進(jìn)行。但是Cell-SELEX也有一些缺點(diǎn)，比如它需要更多的篩選時(shí)間，對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的任何損傷都會(huì)影響篩選結(jié)果。適配體的優(yōu)點(diǎn)：(1)它具有非常廣泛的靶標(biāo)范圍；(2)適配體制備時(shí)間較短，它是在體外制備，從而避免了長(zhǎng)時(shí)間免疫；(3)適配體易于修飾，有較高的穩(wěn)定性；(4)適配體的批與批之間的變化較少；(5)適配體的制備成本比單克隆抗體低；(6)高組織滲透率(由于它們的小尺寸)，脫水形式的穩(wěn)定性高，易于化學(xué)合成；(7)適配體可長(zhǎng)期保存；(8)適配體對(duì)溫度不敏感，可耐受80℃，而單克隆抗體則變性；(9)適配體分子量較小，治療時(shí)很容易穿透腫瘤等組織。此外，適配體還具有靶點(diǎn)廣泛、有高特異性、高親和力、低免疫原性、納米尺寸(直徑約1 ～ 2nm)等諸多優(yōu)點(diǎn)。

1 核酸適配體用于肺腺癌早期診斷和治療的現(xiàn)狀

肺癌仍然是我國(guó)死亡率的榜首，它嚴(yán)重的危害了人類(lèi)的健康。肺癌有兩種組織學(xué)類(lèi)型：非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，非小細(xì)胞肺癌占肺癌病例的80%以上。疾病的分期影響非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后，5年生存率低[4]。其中非小細(xì)胞肺癌可以分為三個(gè)亞型：腺癌、鱗癌和大細(xì)胞肺癌。盡管肺癌的篩查、診斷和治療取得了很大的進(jìn)展，但是有約70%的患者在目前的醫(yī)療環(huán)境下很難被診斷出來(lái)，導(dǎo)致肺癌預(yù)后不良。因此，早期診斷與治療是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵。然而，目前大多數(shù)的肺癌診斷方法，如X射線、螺旋CT、MRI、PET/CT、纖維支氣管鏡檢查、縱隔鏡檢查，光學(xué)相干斷層掃描、正電子發(fā)射斷層掃描[5]，都是基于形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的，但是這些標(biāo)準(zhǔn)對(duì)早期發(fā)現(xiàn)不敏感，對(duì)癌癥也不特異。因此，非小細(xì)胞肺癌的早期診斷和治療越來(lái)越依賴(lài)于分子探針的開(kāi)發(fā)，這些探針可以識(shí)別肺癌發(fā)生發(fā)展中的異常，并使臨床醫(yī)生能夠識(shí)別不同的亞型。尋找更多臨床上有效的肺癌生物標(biāo)志物以及肺癌診斷仍是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。適配子作為一類(lèi)用于疾病診斷和治療的新型分子探針引起了人們的極大關(guān)注。目前為止，已經(jīng)用這種方法篩選出了針對(duì)白血病細(xì)胞、肝細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的適配子。最常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)記物主要包括神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)[6]、前列腺特異抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、CA25、CA53、CA199,然而傳統(tǒng)的肺癌診斷技術(shù)靈敏度特別低，不能發(fā)現(xiàn)早期肺癌患者，因此核酸適配子代替抗體用于臨床檢測(cè)和治療已經(jīng)成為大勢(shì)所趨。

研究發(fā)現(xiàn)，一種新型的Gal-1靶向DNA適配子(AP-74M-545)，通過(guò)恢復(fù)免疫功能來(lái)證明該適配子的抗腫瘤作用，AP-74M-545與Gal-1高親和力結(jié)合。數(shù)據(jù)表明，Gal-1適配子通過(guò)阻斷Gal-1和CD45之間的相互作用而抑制腫瘤生長(zhǎng)，從而從凋亡中拯救T細(xì)胞，恢復(fù)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。這些結(jié)果表明AP-74M-545可能是一種潛在的腫瘤免疫治療策略。Kun Li等人首次以肺癌患者血清為靶點(diǎn)，在肺癌患者血清中篩選出6種與腫瘤標(biāo)志物具有特異性親和力的DNA適配子，為肺癌的早期診斷提供了一種新的高效、準(zhǔn)確的方法。研究通過(guò)消減SELEX技術(shù)篩選與肺癌患者血清有較強(qiáng)親和力的特異性核酸適配子，將羧化瓊脂小球在不同篩選參數(shù)下與肺癌患者血清蛋白結(jié)合，最終獲得6種特異性核酸適配子。為了去除靶分子，例如非靶物種的核酸適配子，首先進(jìn)行陰性篩選。隨后，將回收的上清液和磁珠與肺癌患者血清一起孵育進(jìn)行陽(yáng)性篩選，然后在95℃下處理，獲得肺癌患者血清的特異性ssDNA文庫(kù)。獲得的ssDNA文庫(kù)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)擴(kuò)增，然后結(jié)合鏈霉親和素-親和素小球制備二級(jí)ssDNA文庫(kù)，為下一步適配子的篩選做準(zhǔn)備。最后，通過(guò)第二代基因高通量測(cè)序分析來(lái)確定富集的適體序列和特異結(jié)合靶分子的適體序列的富集含量。結(jié)果顯示所獲得的6個(gè)適配子對(duì)肺癌患者血清具有特異性親和力，而對(duì)健康人血清沒(méi)有特異性親和力，表明所獲得的適配子對(duì)肺癌患者血清具有較高的特異性親和力。

2 核酸適配體偶聯(lián)藥物在肺腺癌治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)厄洛替尼在肺癌治療中具有良好的療效。不幸的是，攜帶TKI耐藥EGFR突變的個(gè)體通常會(huì)對(duì)厄洛替尼產(chǎn)生獲得性耐藥性。為了克服這種耐藥性，有研究者開(kāi)發(fā)了以抗表皮生長(zhǎng)因子適體(APT)結(jié)合殼聚糖(APT-Cs)為穩(wěn)定載體的脂質(zhì)體，脂質(zhì)體因其固有的生物相容性和生物降解性而被認(rèn)為是一種很有前途的藥物載體，具有親水核和疏水殼的雙層納米材料，可以包裹水溶性較差的厄洛替尼[7]。將厄洛替尼輸送到靶部位，將厄洛替尼負(fù)載到apt-Cs錨定的脂質(zhì)體復(fù)合物(apt-CL-E)中，并表征了apt-CL-E的理化性質(zhì)，該納米粒表現(xiàn)出良好的生物穩(wěn)定性和對(duì)APT引導(dǎo)的EGFR突變的癌細(xì)胞的結(jié)合特異性。這種特異性結(jié)合促進(jìn)了apt-CL-E在EGFR突變的癌細(xì)胞中的攝取。細(xì)胞毒性研究表明，APT-CL-E在將厄洛替尼輸送到EGFR突變的癌細(xì)胞中，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和凋亡方面比其非靶向脂質(zhì)體具有優(yōu)勢(shì)。

腫瘤疾病化療也會(huì)發(fā)生耐藥性，所以通過(guò)內(nèi)吞作用選擇性靶向給藥，可以減少藥物劑量和不良反應(yīng)，同時(shí)也能最大限度地提高治療效果。德國(guó)學(xué)者開(kāi)發(fā)了一種疏水性化療藥物(如紫杉醇，PTX)的靶向給藥平臺(tái)，其基礎(chǔ)是聚乙二醇(PEG)與聚己內(nèi)酯(PCL)形成PEG-PCL膠束，并以APTS為靶向基團(tuán)。這些APT-NPs選擇性地將PTX靶向NSCLC A549細(xì)胞模型，并有效地清除了它們，同時(shí)避免了對(duì)正常人其他器官的的毒性作用。結(jié)論研制了一種生物相容性嵌段共聚物PEG-PCL膠束包埋疏水性化療藥物PTX的給藥系統(tǒng)。研究了核酸適體修飾的納米粒子在藥物穩(wěn)定和腫瘤靶向方面的雙重作用，確定了納米粒子上最佳的適配體的濃度，負(fù)載PTX的APT(30)-NPs的尺寸約為15 nm(即在用于癌細(xì)胞靶向的理想尺寸范圍內(nèi)：10-50 nm)。這一顯著的治療窗口可以促進(jìn)最小劑量藥物的給藥，同時(shí)提高化療藥物治療的療效，減少副作用，并降低治療成本。

3 核酸適配體在肺腺癌應(yīng)用中面臨的問(wèn)題及解決方法

由于我們目前對(duì)于疾病的診斷仍然不夠準(zhǔn)確，核酸適配體，它作為一種新型的分子探針[8]，將提供了一種全新的方法，從而對(duì)疾病進(jìn)行診斷和靶向治療。"適配子"它們是在體外從隨機(jī)序列池中挑選出來(lái)的。與以前的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物檢查相比，腫瘤標(biāo)志物篩選出的核酸適配體具有很高的特異性，加上影像學(xué)檢查結(jié)果，能夠使肺腺癌早期診斷更加準(zhǔn)確。核酸適配體有很多優(yōu)勢(shì)，還能進(jìn)行適配體-藥物偶聯(lián)，作用于某個(gè)靶點(diǎn)，起到靶向治療的作用，從而降低化學(xué)藥物的毒性作用。同時(shí)一些適配體還可以被開(kāi)發(fā)成生物傳感器。但是核酸適配體是一把雙刃劍，它還存在著一些問(wèn)題：(1)它的穩(wěn)定性較差，從體外篩選得到的適配體在體內(nèi)容易被核酸酶降解[9]；(2)適配體，體積小(約20kDa)，它可以迅速地從循環(huán)中清除，因此表現(xiàn)出較差的藥動(dòng)學(xué)和治療潛力。對(duì)于這些缺點(diǎn)，可以從以下幾個(gè)方面來(lái)解決上述問(wèn)題(1)通過(guò)一些化學(xué)修飾，可以提高核酸適配體的核酸酶抗性；(2)篩選具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的適配體，如G-四聚體可以提高核酸適配體的穩(wěn)定性；(3) 解決核酸適配體易被腎臟過(guò)濾清除的問(wèn)題，與大分子生物偶聯(lián)，比如偶聯(lián)一些納米材料。上述方法均可提高核酸適配體在體內(nèi)應(yīng)用的有效性，隨著研究的深入，核酸適配體現(xiàn)如今應(yīng)用于肺腺癌早期診斷和靶向治療，給腫瘤的診斷和治療注入了新的生機(jī)。；雖然不同癌細(xì)胞系的許多適配子都在開(kāi)發(fā)，但是當(dāng)前廣泛應(yīng)用的適配體的種類(lèi)仍然非常有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的實(shí)際需求，因此研發(fā)更多的核酸適配體用于癌癥的診斷與治療，將會(huì)使更多患者得到更好的治療。