小檗堿調節翼狀胬肉成纖維細胞增殖能力的機制研究

陳 靜，李 威，匡洪影，樊銳鋒，孫 河

0 引言

翼狀胬肉中醫稱“胬肉攀睛”，表現為結膜下良性纖維結締組織增生，可覆蓋至瞳孔區而嚴重影響視力，是戶外工作人群易發的、對患者生存質量影響嚴重的眼表疾病[1]。翼狀胬肉的發生與環境中的微塵顆粒(PM2.5等)刺激有關，隨著環境污染和PM2.5對人類活動影響的加劇，對此類眼表疾病的發生亦起到推動作用[2]。目前翼狀胬肉治療方式以手術治療為主，但術后的復發率高達20%～70%[3]，且缺乏有效藥物控制胬肉的術后復發。依據胬肉攀睛“心肺風熱、脾胃實熱、虛火上炎”的發病機制，具有“清熱燥濕、瀉火解毒”作用的黃連在中醫治療胬肉攀睛的經典方劑中廣泛應用[4-6]。而對黃連主要成分小檗堿的藥理機制研究表明，小檗堿在多種類型細胞中都能夠誘導細胞凋亡[7-8]。翼狀胬肉成纖維細胞的異常增生是造成胬肉組織形成和復發的關鍵，如果小檗堿能控制胬肉細胞的增殖或凋亡，將對翼狀胬肉的預后起到有益的作用。故本研究使用小檗堿對體外培養的翼狀胬肉成纖維細胞進行干預，觀察小檗堿對人翼狀胬肉成纖維細胞凋亡的影響和凋亡相關因子的表達變化。

表1 引物序列

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1取材翼狀胬肉組織由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院眼科翼狀胬肉患者手術切取獲得。研究方案經黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院倫理委員會審查備案(文件號：HZYLLBA201901)。獲取樣本前，已經充分與患者進行知情同意溝通。

1.1.2藥物和試劑實驗用小檗堿(上海源葉生物科技有限公司，CAT：B21379)、分散酶(Sigma，CAT：D4693)、胰酶(Gibco，CAT：2520056)、小鼠抗人波形蛋白抗體(Proteintech，CAT：60330-1-Ig)、兔抗角蛋白抗體(Proteintech，CAT：26411-1-AP)、CCK8試劑盒(Solarbio，CAT：CA1210)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術，CAT：C1062M)、SYBR Green染料試劑盒(Roche，CAT：04913914001)、線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天生物技術，CAT：C2006)。

1.1.3主要實驗儀器Allegra X-30超速冷凍離心機(美國Beckman)、M7000熒光顯微鏡(美國EVOS)、LC480實時定量PCR儀(美國Roch)、ELX800全自動酶標儀(美國Biotek)。

1.2方法

1.2.1翼狀胬肉成纖維細胞的培養和鑒定

1.2.1.1翼狀胬肉成纖維細胞的體外培養臨床手術切除的翼狀胬肉組織保存于生理鹽水中，1h內帶回實驗室進行操作。胬肉組織經pH=7.4的PBS沖洗3次后用PBS配制的終濃度50μmol/L分散酶37℃孵育1h。隨后剪碎胬肉組織，同時加入2.5g/L胰酶37℃消化5min，使用移液器吹散組織塊充分釋放單細胞。使用孔徑為40μm的細胞篩網對細胞懸液進行過濾，將分離后的細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養液37℃，5% CO2條件下進行培養，2～3d更換培養液1次，穩定傳代3～5次后用于后續研究。

1.2.1.2人翼狀胬肉成纖維細胞的鑒定穩定生長的翼狀胬肉細胞經2.5g/L胰酶消化后接種于24孔培養板中，待細胞生長鋪滿板底70%左右面積時，移除培養液并使用4%多聚甲醛對細胞進行固定。固定后的細胞經0.5% Triton X-100室溫透膜30min和5% BSA室溫封閉1h后加入用5% BSA稀釋的含有1%小鼠抗人波形蛋白單抗和1%兔源角蛋白多抗的一抗混合物，4℃過夜孵育。孵育結束后PBS清洗3次，加入5% BSA稀釋的含1% FITC標記的山羊抗小鼠二抗及1% TRITC標記的山羊抗兔二抗混合物，室溫孵育30min后，經PBS洗滌和DAPI復染后，使用熒光顯微鏡，觀察發射波長530nm波形蛋白表達情況和發射波長630nm角蛋白表達情況。同時以人宮頸癌上皮細胞(Hela細胞)作為熒光染色的陽性對照。

1.2.2小檗堿藥物作用濃度的確定實驗用小檗堿使用DMSO配制成濃儲液。正式實驗前，使用96孔板培養翼狀胬肉成纖維細胞，將初始細胞濃度調整為1×103cells/mL，待細胞貼壁生長后，按照濃度梯度分別向培養液中加入終濃度為10、20、40、80、160μmol/L的小檗堿，每組設4個復孔。待培養24h后，移除培養液并使用PBS清洗細胞3次后，每個培養孔中加入100μL CCK8反應液，5% CO2孵箱37℃條件孵育1h后，使用酶標儀測定450nm波長處吸光度值(OD值)。使用GraphPad Prism 7.0軟件對所獲得的小檗堿濃度梯度處理后各組細胞的光吸收值進行非線性分析，得到小檗堿培養翼狀胬肉成纖維細胞24h的IC50值為83.22μmol/L，在后續研究中我們以IC50值為參考進行小檗堿藥物濃度的設定。

1.2.3實驗分組和藥物處理我們將體外培養的翼狀胬肉成纖維細胞隨機分為4組，對照組為不加小檗堿的正常細胞，以小檗堿IC50濃度為最高濃度處理組(80μmol/L)，并按照濃度梯度50%遞減的原則設立中間濃度40μmol/L和低濃度20μmol/L處理組。所有細胞中均加入等量的用于溶解小檗堿的DMSO，各組細胞培養24h后，收集細胞用于后續檢測。

1.2.4各組翼狀胬肉成纖維細胞凋亡比率檢測各組細胞培養24h后，使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒按照試劑盒推薦步驟，對細胞進行染色后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡比率。

1.2.5各組翼狀胬肉成纖維細胞實時定量PCR檢測各組細胞在培養結束后使用Trizol法抽提細胞內總RNA，使用反轉錄酶對mRNA進行反轉錄后，使用SYBR Green染料法和LC480實時定量熒光PCR儀對目標基因進行擴增，采用2-△△CT法計算目標基因的相對表達水平，所檢測指標的具體引物序列見表1。

圖1 體外培養翼狀胬肉成纖維細胞的鑒定(×100)。

圖2 流式細胞術檢測翼狀胬肉成纖維細胞凋亡水平 A：對照組；B：20μmol/L小檗堿組；C：40μmol/L小檗堿組；D：80μmol/L小檗堿組。

1.2.6各組翼狀胬肉成纖維細胞Western blot檢測各組翼狀胬肉細胞使用RIPA裂解液冰浴狀態下裂解，按每組每個指標50μg總蛋白的標準經8% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白后，采用半干轉印的方式(20V，40min)將凝膠中的蛋白轉印至PVDF膜上，PVDF膜經TBST漂洗3次后，5%脫脂牛奶封閉，分別應用封閉液配制的兔源多克隆抗Bcl-2抗體(Abcam，CAT：ab196495，1∶2000)、兔源多克隆抗Bad抗體(Abcam，CAT：ab90435，1∶2000)、兔源單克隆抗Bax抗體(Abcam，CAT：ab182733，1∶2000)及小鼠源單克隆抗β-actin抗體(Santa Cruz，CAT：sc-70319，1∶2000)4℃孵育過夜。過夜孵育后，使用TBST漂洗PVDF膜3次，每次5min。隨后除β-actin加入山羊抗小鼠HRP標記的IgG二抗(中杉金橋，CAT：ZB-2305，1∶5000)，其余因子均加入山羊抗兔HRP標記的IgG二抗(中杉金橋，CAT：ZB-2301,1∶5000)室溫孵育1h后，加入ECL發光液，使用GelDoc EZ凝膠成像系統(美國BioRad)進行放射自顯影檢測，所獲得的圖像經軟件分析密度與面積，目標蛋白的相對表達水平=(目標基因密度×面積)/(同組β-actin密度×面積)。

1.2.7各組翼狀胬肉成纖維細胞線粒體膜電位檢測(JC-1染色)線粒體膜電位染色使用線粒體膜電位檢測試劑盒按照推薦步驟進行操作，并使用熒光顯微鏡對JC-1染色后細胞530nm綠色熒光和590nm紅色熒光信號進行拍照鏡檢；同時使用流式細胞儀以530nm熒光為橫軸，590nm熒光為縱軸對檢測結果進行分析。圈選對照組細胞分布集中區域設定為未發生去極化的正常細胞，并同一標準對不同濃度小檗堿處理后的細胞進行圈選，比較圈選范圍內未發生去極化細胞比率的差異。

2 結果

2.1體外培養翼狀胬肉成纖維細胞鑒定Hela細胞、體外培養翼狀胬肉細胞的波形蛋白和角蛋白染色結果見圖1。體外培養翼狀胬肉成纖維細胞波形蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，符合成纖維細胞的蛋白表達特征。Hela細胞作為陽性對照，其角蛋白和波細胞形蛋白都呈現陽性結果，說明熒光雙染的鑒定方案可行。熒光染色結果證明，所培養的細胞確定為成纖維細胞，且純度較高，可用于后續研究。

2.2細胞凋亡比率檢測結果各組細胞采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑染色并經流式細胞儀檢測后的結果見圖2，經流式細胞儀檢測后Q1象限為死亡細胞，Q2象限為晚期凋亡細胞，Q3象限為正常細胞，Q4象限為早期凋亡細胞。從結果可以看出，不同濃度小檗堿處理24h后，四組間凋亡率差異有統計學意義(F=382.75，P<0.001)，隨著小檗堿濃度的提高，Q2和Q4象限細胞比率逐漸增加，說明小檗堿以劑量依賴的方式促進細胞凋亡的發生。以Q2和Q4象限細胞所占比例之和代表細胞凋亡的總比例，與未加小檗堿的對照組相比，終濃度20、40和80μmol/L小檗堿處理后細胞凋亡比率均顯著升高(P<0.05)，并且隨著小檗堿濃度的提高，其凋亡比率呈現明顯的劑量依賴趨勢(表2)。

2.3凋亡相關細胞因子表達水平檢測結果四組間抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表達水平比較，差異有統計學意義(F=717.71，P<0.001)；與未加入小檗堿的對照組相比，Bcl-2蛋白表達水平隨著小檗堿終濃度的提高而顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與之相對應的是Bax和Bad這兩個促凋亡基因的蛋白表達水平，四組間Bax和Bad蛋白水平比較，差異有統計學意義(F=243.24、297.51，P<0.001)，且隨著小檗堿濃度的提高而明顯增加。對蛋白表達強度的灰度分析表明，與對照組相比促凋亡因子Bax和Bad蛋白表達水平隨著小檗堿終濃度的提高而逐漸增高，在40、80μmol/L小檗堿處理后翼狀胬肉成纖維細胞中Bax和Bad蛋白表達水平與不加小檗堿的對照組相比均顯著升高(Bax：20μmol/L，P=0.180；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001。Bad：20μmol/L，P=0.218；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001，圖3，表2)。

表2 不同濃度小檗堿處理24h對細胞凋亡和凋亡蛋白表達的影響

注：aP<0.05，bP<0.01vs對照組。

表3 不同濃度小檗堿處理24h后未發生線粒體去極化細胞比率和凋亡基因mRNA的表達

注：aP<0.05，bP<0.01vs對照組。

凋亡相關因子mRNA表達水平的檢測結果與蛋白表達水平的趨勢類似，四組間Bcl-2、Bcl-xl、Bad和Bax mRNA的表達比較，差異有統計學意義(F=165.10、154.99、851.71、22.48，P<0.001，表3)。隨著小檗堿終濃度的提高，抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl mRNA表達水平與對照組相比呈現出逐漸降低的趨勢，尤其是40、80μmol/L小檗堿組中Bcl-2和Bcl-xl mRNA表達水平與對照組相比均顯著降低(Bcl-2：20μmol/L，P=0.003；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001。Bcl-xl：20μmol/L，P=0.338；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001)，而促凋亡因子Bax和Bad mRNA表達水平與對照組相比則呈顯著逐漸升高的趨勢(Bax：20μmol/L，P=0.115；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001。Bad：20μmol/L，P=0.017；40μmol/L，P<0.001；80μmol/L，P<0.001)。

2.4細胞線粒體JC-1染色結果在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物產生590nm紅色熒光；而在去極化狀態下即線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體，可以產生530nm的綠色熒光。結果表明，隨著小檗堿濃度的增加，細胞內綠色熒光強度逐漸增加，說明細胞線粒體去極化水平逐漸提高(圖4A)；流式細胞儀檢測結果也表明，隨著小檗堿濃度的提高，流式細胞檢測圈選范圍內即P1區細胞總體數量顯著降低(圖4B)。對未發生線粒體去極化的翼狀胬肉細胞所占比率的統計結果也表明，四組間差異有統計學意義(F=130.81，P<0.001，表3)。與對照組相比，隨著小檗堿終濃度的提高，未發生線粒體去極化的正常細胞比率顯著降低(20μmol/L：P=0.413；40μmol/L：P=0.001；80μmol/L：P<0.001)，說明小檗堿以劑量依賴的方式對翼狀胬肉成纖維細胞線粒體膜電位產生影響。

圖3 Western blot 檢測翼狀胬肉成纖維細胞中凋亡蛋白Bcl-2、Bad、Bax 表達水平。

3 討論

中醫認為翼狀胬肉的發病機制與五臟密切相關，心通過手少陰心經直接與目相連，心經邪熱可直接上擾于目；眼球暴露于外，外感風熱之邪客于心肺兩經，心肺風熱壅盛，經絡瘀滯，則胬肉脹起；眾人多飲食不節損傷脾胃，內生濕熱壅滯眼絡；過度勞欲，心陰暗耗，虛火上炎于目所致。而現代醫學認為翼狀胬肉是細胞凋亡與增生失衡導致的增生性眼表疾病，具體發病機制雖較為復雜，但目前公認的是翼狀胬肉成纖維細胞異常增生是導致疾病發生的主要原因[9]，而翼狀胬肉成纖維細胞與腫瘤細胞存在類似的生物學行為[10]。對翼狀胬肉組織中凋亡相關因子的研究發現，抗凋亡基因Bcl-2在翼狀胬肉中表達強度明顯高于正常結膜組織，且在復發性胬肉中Bcl-2基因的表達水平高于初發胬肉[11-12]。這說明在翼狀胬肉成纖維細胞中凋亡基因的表達水平處于異常的狀態，通過調控凋亡相關基因的表達水平可能對翼狀胬肉細胞的異常增殖起到控制作用。

圖4 不同終濃度小檗堿作用24h后細胞線粒體去極化情況 A：翼狀胬肉成纖維細胞JC-1染色結果(×100)；B：流式細胞術檢測細胞線粒體去極化結果。

對小檗堿抑制腫瘤細胞生長的研究結果表明，在結腸癌和胸腺癌細胞中小檗堿能夠通過降低Bcl-2的表達水平，誘導腫瘤細胞發生凋亡[13-14]。而我們對體外培養的翼狀胬肉成纖維細胞中凋亡基因mRNA和蛋白的表達水平的檢測也發現，小檗堿能夠下調體外培養的翼狀胬肉成纖維細胞中Bcl-2和上調Bax、Bad mRNA的表達水平，而且對這些凋亡相關因子mRNA和蛋白表達水平的調節都呈現出明顯的劑量性。細胞凋亡的趨勢與Bcl家族抗凋亡基因與促凋亡基因的表達比率有關[15]，抗凋亡因子Bcl-2的表達量降低和促凋亡因子Bax、Bad表達量的提高將可能造成細胞凋亡比率的提升，這一結果也與流式細胞術對細胞凋亡比率的檢測結果相一致。Bcl家族分子則主要分布在線粒體內膜，對線粒體功能的變化較為敏感[16]。我們前期在人卵巢顆粒細胞(KGN細胞)的研究結果表明，小檗堿能夠通過劑量依賴的方式促進線粒體SIRT3因子的泛素化，從而可能對線粒體機能產生影響[17]。相關研究表明，小檗堿能夠在體外培養HepG2細胞線粒體局部聚集[18]，而在體外培養的B細胞中小檗堿能夠以劑量依賴的方式誘導細胞凋亡的發生[19]。在本研究中，小檗堿以劑量依賴的方式提高了翼狀胬肉成纖維細胞的線粒體去極化水平及細胞凋亡比率，我們推測小檗堿抑制翼狀胬肉成纖維細胞增殖的藥理機制很可能與其對線粒體功能的調節有關。

線粒體是重要的能量代謝細胞器，線粒體功能的穩定與細胞的存活密切相關。由于線粒體內膜兩側質子不均勻分布產生質子梯度，形成線粒體膜內負外正的電壓差，線粒體膜電位是保持線粒體功能正常所必需的[20]。而當線粒體受到不良因素影響或衰老時線粒體內膜的電壓差減小或消失即發生去極化現象，去極化現象預示著線粒體功能的弱化及細胞能量代謝水平的下降，同時線粒體去極化比率的提高也是細胞凋亡的早期標志性事件之一[21]。本研究結果顯示，隨著培養系統中小檗堿濃度的提高，JC-1單體綠色熒光強度逐漸增強，說明小檗堿顯著降低了線粒體的膜電位。同時流式細胞術的檢測結果也表明，隨著小檗堿濃度的提高，未發生線粒體去極化的細胞比例也逐漸降低。這些結果表明，小檗堿可能通過影響線粒體膜電位從而啟動翼狀胬肉成纖維細胞的凋亡機制。

綜合以上結果表明，黃連的主要成分小檗堿能夠顯著提高翼狀胬肉細胞線粒體去極化水平、細胞凋亡比率和凋亡相關因子的表達水平。黃連味苦、性寒，入心、脾、胃、肝、大腸經，直瀉心肺兩經風熱，燥脾胃濕熱，清心瀉火解毒，針對胬肉攀睛“心肺風熱，虛火上炎”之病因病機而治本。小檗堿對翼狀胬肉成纖維細胞線粒體機能的調節可能在一定程度上解釋了這一中醫理論的生物學機制。同時凋亡相關因子的表達及線粒體去極化水平的檢測也顯示，線粒體很可能是小檗堿的細胞內作用靶點，通過激活線粒體途徑從而誘發細胞凋亡的發生。有研究顯示，小檗堿能夠抑制線粒體復合體的生物學活性，從而對線粒體功能產生影響，這也從另一個方面印證了線粒體可能是小檗堿的藥效靶點[22]。雖然本研究發現小檗堿促進翼狀胬肉成纖維細胞的凋亡，但目前有關小檗堿對不同細胞凋亡調節作用的研究結果并不一致，也有研究表明小檗堿也對線粒體凋亡途徑起到抑制作用[23-24]。我們推測造成小檗堿對細胞凋亡調節作用的差異可能與小檗堿作用濃度和所研究的細胞類型有關。而我們在翼狀胬肉成纖維細胞中發現的小檗堿促進胬肉細胞凋亡的研究結果，為進一步明確中藥療效的藥理機制及推動中藥在眼表疾病治療方面的應用提供了有力的數據支持。