pH依賴型脂肪酸輔助的分散液-液微萃取與高效液相色譜儀聯(lián)用測(cè)定水樣中3種多環(huán)芳烴

孫孟華，金 倩，陳慶芝，李曉敬，趙 燁，趙 陽(yáng)

(河北省地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心，河北 保定 071051)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的稠環(huán)碳?xì)浠衔颷1]。PAHs是最早被發(fā)現(xiàn)具有致癌作用的物質(zhì)，并且具有致畸性和致突變性[2]。隨著工業(yè)的發(fā)展，煤和石油等消耗急劇上升，PAHs作為有機(jī)材料不完全燃燒或者熱解的產(chǎn)物廣泛存在于環(huán)境中[3-4]。近年來綠色樣品前處理方法的研究主要集中于減少有機(jī)溶劑用量、縮短萃取時(shí)間和節(jié)約成本，并相繼出現(xiàn)了各種各樣的萃取方法[5-6]，如固相微萃取(SMPE)[7]、液-液微萃取(LLE)、單滴微萃取(SDME)、中空纖維液相微萃取(HF-LPME)[8]和分散液-液微萃取(DLLME)[9-11]等。其中分散液-液微萃取(DLLME)由于其簡(jiǎn)單、快速、富集效果好的特點(diǎn)得到了分析工作者的青睞。新型的分散溶劑(如離子液體、中鏈飽和脂肪酸、表面活性劑等)常用來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的DLLME中經(jīng)常使用的分散溶劑[12]。DLLME中常用的輕質(zhì)萃取劑(如烷烴類、脂肪醇類等)在與水的混合液離心后可漂浮于水相上方，但其聚集狀態(tài)的不完整導(dǎo)致了與水相分離的困難。解決這一問題可采用較細(xì)尖端的容器如塑料吸管、注射器等將萃取劑聚于容器頂端以利于其收集。Tehrani 等[13]利用表面活性劑輔助的分散液-液微萃取法萃取尿液中的苯丙胺，縮短了萃取時(shí)間；付博等[9]利用漂浮液滴固化分散液-液微萃取與高效液相色譜聯(lián)用檢測(cè)環(huán)境水樣中的3 種烷基苯酚，使用冷凍固化萃取劑的方式使之與水相分離，從而達(dá)到回收分析物的目的；Shih等[14]將1-辛醇作為分散液-液微萃取方法的萃取劑，通過酸堿作為 pH 調(diào)節(jié)劑，與磁性固相微萃取技術(shù)相結(jié)合對(duì)環(huán)境水樣中的烷基苯酚進(jìn)行了分離和萃取。這些利用表面活性劑、漂浮液滴固化以及與磁性固相微萃取技術(shù)相結(jié)合的分散液-液微萃取方法操作簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保，可達(dá)到預(yù)期效果。

目前檢測(cè) PAHs 的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[15-16]、高效液相色譜紫外/熒光檢測(cè)法(HPLC UV/FLD)[17]等。但GC-MS法對(duì)于熱穩(wěn)定性較差的多環(huán)芳烴的檢測(cè)效果較差，且脂類物質(zhì)易在氣相色譜系統(tǒng)的進(jìn)樣口、毛細(xì)管柱及質(zhì)譜的離子源處積聚，增加了基線噪聲，影響了儀器的分析性能[15]。氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)依靠保留時(shí)間和碎片離子進(jìn)行定性，結(jié)果更為可靠，但其靈敏度不如液相色譜法高，難以滿足痕量PAHs 的測(cè)定[16]。為了彌補(bǔ)這種不足，本研究選擇高效液相色譜法分析水樣中的多環(huán)芳烴。在已有研究基礎(chǔ)上，本文以脂肪酸(正庚酸)作為新型DLLME萃取劑，利用濃氨水和濃硫酸調(diào)節(jié)溶液pH值，建立了pH依賴型脂肪酸輔助的分散液-液微萃取方法，并與高效液相色譜聯(lián)用檢測(cè)了環(huán)境水樣中的3種多環(huán)芳烴，驗(yàn)證了正庚酸作為DLLME萃取劑的適用性，為水樣中菲、芘和苊的檢測(cè)提供了環(huán)境友好的新前處理方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

菲、芘、苊購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；正庚酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；28%濃氨水、98%濃硫酸、乙腈(色譜純)均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇(天津市康科德科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水(電導(dǎo)率≥18 MΩ·cm)，所用試劑若未說明均為分析純，且使用前無需進(jìn)一步純化。用乙腈配制5 μg/mL菲、芘和苊混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于 4 ℃密封保存，使用時(shí)用水稀釋至所需的濃度。

LC-20AD型高效液相色譜儀，SPD-20A紫外可見分光光度檢測(cè)器(日本島津公司)；LG10-2.4A高速離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)；KQ5200E超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS204S型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)。

1.2 高效液相色譜檢測(cè)條件

色譜柱：Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃。流動(dòng)相：乙腈-水(53∶47,體積比)，臨用前過0.2 μm微孔濾膜，流速為1 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL，采用雙波長(zhǎng)模式檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為λ=265 nm、λ=290 nm。

1.3 萃取原理

脂肪酸是一種在溶液中通過改變pH易離子化的化合物，并且可以產(chǎn)生具有表面活性劑性能(在油和水相中可以產(chǎn)生膠束)的親水基團(tuán)。將萃取劑正庚酸加入樣品溶液中，由于其與水相不互溶而懸浮在溶液表面。當(dāng)加入28%濃氨水將溶液調(diào)至堿性時(shí)，大約99.9%的脂肪酸呈離子狀態(tài)形成膠束，疏水性的多環(huán)芳烴被萃取至膠束中。當(dāng)加入98%濃硫酸將溶液調(diào)至酸性時(shí)(約比正庚酸的pKa值小3)，超過99.9%的脂肪酸會(huì)返至最初的疏水狀態(tài)，從而帶著目標(biāo)萃取物與水相分離(原理如圖1所示)。本文通過調(diào)節(jié)溶液的pH值以改變正庚酸的存在狀態(tài)，從而完成對(duì)水相中多環(huán)芳烴的萃取，并通過與HPLC聯(lián)用檢測(cè)了自來水、井水和海水樣品中的菲、芘和苊。

圖1 pH依賴型脂肪酸輔助的分散液-液微萃取的反應(yīng)機(jī)理Fig.1 Mechanisms of molecule interactions in pH-dependent fatty acid-assisted dispersion liquid-liquid microextraction

圖2 pH依賴型脂肪酸輔助的分散液-液微萃取過程示意圖Fig.2 Schematic diagram of pH-dependent fatty acid-assisted dispersion liquid-liquid microextraction

1.4 脂肪酸輔助的分散液-液微萃取過程

脂肪酸輔助的分散液-液微萃取過程如圖2所示，準(zhǔn)確量取5 mL水樣置于玻璃試管中，加入一定量的多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，55 μL正庚酸，搖勻。再向水樣中加入50 μL 28%濃氨水，手搖使其混合均勻，此時(shí)溶液變清澈。振搖30 s后加入500 μL 98%濃硫酸，此時(shí)溶液呈乳濁液狀態(tài)。將試管置于離心機(jī)中，3 500 r/min離心3 min后，用針管取出上層正庚酸，取5 μL注入HPLC進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取劑種類的選擇

DLLME 方法要求其萃取劑的熔點(diǎn)接近室溫(10～30 ℃)，且密度小于水。本實(shí)驗(yàn)中，作為pH依賴型萃取溶劑的中等長(zhǎng)度飽和脂肪酸的選擇對(duì)萃取效率起著至關(guān)重要的作用，脂肪酸中烷基鏈的碳數(shù)影響其兩親特征。因此，考察了3種不同飽和脂肪酸(正己酸、正庚酸和正辛酸)作為萃取溶劑對(duì)多環(huán)芳烴的萃取性能。在5 mL加標(biāo)1 μg/L的水樣中分別加入55 μL飽和脂肪酸，50 μL 28%濃氨水，手搖使溶液均勻，再加入500 μL 98%濃硫酸得到渾濁溶液，離心使飽和脂肪酸與水相分離。結(jié)果顯示，由于正己酸在室溫下具有高的水溶性，在脂肪酸輔助的分散液-液微萃取中不能與水相分離，只有正庚酸和正辛酸可以作為萃取劑完成后續(xù)研究。進(jìn)一步研究這兩種脂肪酸的萃取性能(圖3)，結(jié)果表明，正庚酸的萃取效率較高，且其作為萃取劑時(shí)獲得的色譜圖中雜質(zhì)干擾較少。因此，在后續(xù)研究中，選擇正庚酸作為萃取溶劑。

2.2 萃取劑用量的優(yōu)化

在脂肪酸輔助的分散液-液微萃取中，萃取劑用量也是影響萃取效率的一個(gè)重要因素。當(dāng)正庚酸的體積小于20 μL時(shí)不能順利地從玻璃管中取出，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的可操作性降低，正庚酸的回收體積低，影響了萃取效率，因此考察了萃取劑(正庚酸)用量對(duì)萃取效率的影響。將30～70 μL正庚酸分別加至5 mL水樣(含有1 μg/L的菲、芘和苊)，再向水樣中加入50 μL 28%濃氨水，手搖使其混合均勻，最后加入500 μL 98%濃硫酸，得到一種渾濁溶液，離心使飽和脂肪酸與水相分離。結(jié)果表明，隨著萃取劑體積的增加，3種目標(biāo)分析物的萃取回收率逐漸提高。當(dāng)正庚酸的體積高于55 μL時(shí)，3種目標(biāo)物的萃取回收率均趨于穩(wěn)定，但富集倍數(shù)隨正庚酸體積的增大而下降，為了保證具有較高的回收率和較大的富集倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)選擇正庚酸的用量為55 μL。

2.3 28%濃氨水用量的優(yōu)化

當(dāng)溶液pH值比脂肪酸在水中的平衡解離常數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù)(pKa)大3以上時(shí)，大部分脂肪酸可被轉(zhuǎn)換為其陰離子形式，從而溶于水形成表面活性劑膠束。在脂肪酸輔助的分散液-液微萃取中，28%濃氨水的用量會(huì)影響正庚酸的轉(zhuǎn)化，其用量越大，正庚酸轉(zhuǎn)化為表面活性劑的量越多。然而，加入過多28%濃氨水時(shí)，則需要更多量的98%濃硫酸中和以將銨化的表面活性劑轉(zhuǎn)化為正庚酸。考察了不同氨水用量對(duì)3種多環(huán)芳烴萃取回收率的影響，將55 μL正庚酸加至5 mL水樣(含有1 μg/L的菲、芘和苊)，再向水樣中分別加入30～70 μL 28%的濃氨水，手搖使其混合均勻后，加入500 μL 98%的濃硫酸，得到一種渾濁溶液，離心使飽和脂肪酸與水相分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)加入50 μL 28%的濃氨水時(shí)，正庚酸對(duì)水樣中多環(huán)芳烴的萃取效率達(dá)到最高，繼續(xù)增大濃氨水的體積，其萃取效率幾乎無明顯變化。因此，實(shí)驗(yàn)選擇加入50 μL 28%濃氨水調(diào)節(jié)溶液pH值。

2.4 98%濃硫酸用量的優(yōu)化

由于濃硫酸的用量會(huì)影響表面活性劑轉(zhuǎn)化為疏水性脂肪酸的量，從而影響方法的萃取效率。為了優(yōu)化其用量，考察了加入300～700 μL 98%濃硫酸對(duì)3種多環(huán)芳烴回收率的影響。將55 μL的正庚酸分別加至5 mL水樣中(含有1 μg/L的菲、芘和苊)，再向水樣中加入50 μL 28%濃氨水，手搖使其混合均勻后，加入300～700 μL 98%濃硫酸，得到一種渾濁溶液，離心使飽和脂肪酸與水相分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)98%濃硫酸的用量從300 μL增至500 μL時(shí)，多環(huán)芳烴的萃取效率顯著提高，這是因?yàn)殡S著濃硫酸用量的增加，會(huì)形成更多中性介質(zhì)的正庚酸，有利于萃取效率的提高。當(dāng)98%濃硫酸用量大于500 μL時(shí)，萃取效率趨于穩(wěn)定。經(jīng)驗(yàn)證，當(dāng)加入500 μL 98%濃硫酸時(shí)，溶液的pH大約為0.52，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正庚酸的pKa。因此，選擇500 μL作為98%濃硫酸的最佳用量。

2.5 離心時(shí)間的優(yōu)化

在脂肪酸輔助的分散液-液微萃取中，需要通過離心使正庚酸與水相分離，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多環(huán)芳烴的萃取，為此考察了離心時(shí)間的影響。將55 μL正庚酸分別加至5 mL水樣(含有1 μg/L的菲、芘和苊)，再向水樣中加入50 μL 28%濃氨水，手搖使其混合均勻后，加入500 μL 98%濃硫酸，得到一種渾濁溶液，分別離心1～5 min使飽和脂肪酸與水相分離。結(jié)果顯示，當(dāng)離心時(shí)間過短時(shí)，正庚酸尚未與水相完全分離，從而使獲得的正庚酸體積少，萃取率低。隨著離心時(shí)間的延長(zhǎng)，相分離逐漸完全，得到的正庚酸相應(yīng)增多，回收率逐漸提高，當(dāng)離心時(shí)間為3 min時(shí)，回收率達(dá)到最高，繼續(xù)延長(zhǎng)離心時(shí)間，回收率無明顯提高。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇3 min作為最佳離心時(shí)間。

2.6 鹽效應(yīng)

向10 mL 水樣中加入0～10 g NaCl，以考察鹽濃度對(duì)3 種多環(huán)芳烴萃取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽濃度對(duì)分析物的富集倍數(shù)幾乎無影響。本實(shí)驗(yàn)的3 種目標(biāo)分析物均為多環(huán)芳烴，加入NaCl可能對(duì)分析物具有鹽析效應(yīng)，使更多的分析物溶解于有機(jī)相之中。但加鹽后收集到的萃取劑體積明顯大于不加鹽時(shí)所收集到的萃取劑體積，產(chǎn)生了稀釋效應(yīng)，推測(cè)稀釋效應(yīng)與鹽析效應(yīng)相抵消導(dǎo)致鹽濃度對(duì)萃取效率幾乎無影響。為了提高實(shí)驗(yàn)的可操作性，選擇加入0.5 g NaCl，以保證萃取后可以回收到足夠體積的萃取劑，便于下一步的進(jìn)樣分析。

2.7 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

選擇合適的測(cè)定波長(zhǎng)對(duì)于樣品的檢測(cè)至關(guān)重要，應(yīng)該以雜峰少，且分離效果好，被測(cè)元素的吸收波長(zhǎng)處無雜峰干擾為原則。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，最終確定采用雙波長(zhǎng)測(cè)定方法，其中菲和苊的檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm，芘的檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。

2.8 方法的可靠性驗(yàn)證

2.8.1 線性范圍與檢出限為了驗(yàn)證方法的可靠性，分別在水樣中加入5種不同質(zhì)量濃度的多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)條件下萃取目標(biāo)分析物并用高效液相色譜儀進(jìn)行定性和定量分析。每種濃度平行做3次，由低濃度向高濃度進(jìn)樣，計(jì)算各質(zhì)量濃度水平上的峰面積，并對(duì)其進(jìn)行線性擬合。結(jié)果顯示，菲、芘和苊在20～500 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 3。以3倍信噪比(S/N=3)為基準(zhǔn)，將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，得出菲、芘和苊的檢出限分別為13.11、10.48、9.18 μg/L(見表1)。

表1 菲、芘和苊的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 1 Linear ranges，regression equations,correlation coefficients(r2)and LODs of phenanthrene,pyrene and acenaphthene

y：peak area；x：mass concentration(μg/L)

2.8.2 精密度與重現(xiàn)性在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下萃取水中的多環(huán)芳烴，連續(xù)制備樣品6次，用所建立的方法對(duì)其保留時(shí)間及峰面積求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，3種分析物保留時(shí)間及峰面積的RSD 均不大于3.3%，證明方法有良好的日內(nèi)精密度。用本方法對(duì)連續(xù)6天制備相同濃度水平的樣品進(jìn)行日間重現(xiàn)性測(cè)定，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD。結(jié)果顯示，3種分析物保留時(shí)間及峰面積的RSD 均不大于4.2%，表明方法具有良好的日間精密度。

2.8.3 實(shí)際樣品分析與回收率測(cè)定為驗(yàn)證方法的可行性，將自來水(采自本實(shí)驗(yàn)室)、井水(采自保定市蠡縣)和海水(采自渤海)作為實(shí)際樣品，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾后，在最佳萃取條件下測(cè)定3種實(shí)際水樣中的菲、芘、苊殘留。結(jié)果顯示3種水樣中均未檢出目標(biāo)分析物。

為了考察基體效應(yīng)，向自來水、井水和海水樣品中分別加入3種質(zhì)量濃度水平(0.5、5、50 μg/L)的多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，用所建立的方法進(jìn)行樣品預(yù)處理和分析檢測(cè)，每種濃度平行做3次，計(jì)算其加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)定結(jié)果如表2所示，菲、芘、苊的回收率分別為87.9%～110%、98.9%～110%、88.9%～108%，RSD均不大于3.0%，表明此方法可用于實(shí)際水樣菲、芘、苊的檢測(cè)。圖4為海水及海水加標(biāo)樣品的色譜圖。

表2 多環(huán)芳烴在自來水、井水及海水中3種加標(biāo)水平下的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 2 Recoveries and RSDs of PAHs from tap water,well water and sea water at three spiked levels(n=3)

3 結(jié) 論

本文通過對(duì)萃取劑種類、萃取劑用量、28%濃氨水用量、98%濃硫酸用量以及離心時(shí)間等條件的探索，建立了一種水樣中PAHs檢測(cè)的新方法。與已報(bào)道的前處理方法相比，本方法選用正庚酸作為萃取溶劑，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值實(shí)現(xiàn)水樣中PAHs的萃取。實(shí)驗(yàn)過程無需任何特殊裝置即可對(duì)萃取劑進(jìn)行收集，整個(gè)萃取過程僅需6 min，提高了萃取效率，節(jié)省了時(shí)間；采用高效液相色譜儀作為檢測(cè)手段，提高了方法的靈敏度和再現(xiàn)性，獲得了可靠的分析結(jié)果，方法有望拓展于其他化合物的萃取及測(cè)定。