松弛素家族及其受體在精子發生過程中的作用研究進展

董盼攀 楊凱 張天宇 曾慶琪

松弛素（relaxin，RLN）是 1926年由 Dr.Frederick Hisaw在地鼠和豚鼠的性腺激素中發現并命名的一種短循環多肽激素，在妊娠、分娩及其他女性生殖方面起重要作用。人類RLN家族多肽包括RLN1、RLN2、RLN3和類胰島素多肽（insulin like peptides，INSL）3、INSL4、INSL5、INSL6兩大類。成熟的多肽由二硫鍵連接的A、B兩條肽鏈組成，其中B鏈有些氨基酸殘基是RLN分子受體識別位點的重要部分。不同物種RLN的結構、生物學作用差異很大[1]。隨著研究的不斷深入，有學者發現RLN對非生殖系統起到抗纖維化、舒張血管以及促進組織愈合等作用[2-3]。自從2007年Agoulnik[4]在精液中發現RLN家族及其受體，其在男性生殖領域也成為了研究的熱點，但作用仍存在爭議。本文就RLN家族及其受體在精子發生過程中的作用及可能的機制作一綜述。

1 RLN家族及其受體分布

人類的RLN基因從cDNA數據庫中分離，并通過質譜法進行鑒定。在靈長目動物中，RLN通過復制，產生了RLN1和RLN2。RLN2是生物進化過程中RLN1的直系同源基因，兩者分子結構非常接近，僅13個氨基酸序列排列有別，其中RLN2是組織儲存及血液中存在的主要形式。卵巢和前列腺是RLN2的主要來源[5]。早在1998年，Steinetz等研究提出，RLN3是所有RLN家族最原始的多肽，但目前大多研究認為RLN3是一種神經肽，主要參與攝食調節、壓力、記憶等腦部的神經調節[6]。RLN3復制以后產生INSL5。與RLN3一樣，INSL5維持非性腺表達模式，主要參與胃腸道調節。INSL4和INSL6與兩性和mab3相關轉錄因子1（doublesex-mab3-related transcription factor1，DMRT1）基因緊密連鎖，參與脊椎動物古老的性別決定，在生殖功能中發揮作用[7]。

RLN受體是G蛋白偶聯受體，也稱為RLN家族肽受體（receptors for relaxin and related peptides，RXFP）。胰島素RLN肽類激素家族的進化還伴隨著使用的受體的連續變化。RLN是RXFP1的內源性配體，RXFP1與RLN的親和力是RXFP2的5倍。RXFP2也是INSL3的受體。當RLN3復制產生INSL5時，受體也從RXFP3復制成為RXFP4。這兩種受體主要與磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）和 Ca2+細胞內信號通路相關[8-9]。截止目前，INSL4、INSL6的受體尚未見相關報道[10]。

2 RLN家族對精子發生的影響

RLN家族及其受體在不同組織的共表達提示RLN可能存在自分泌和旁分泌作用。雖然目前已有研究表明男性生殖系統存在部分RLN家族及其受體，但其對精子的發生及作用過程尚未十分明確[11]。Pimenta等[12]通過培養大鼠睪丸細胞發現，與對照組相比，RLN對生殖細胞群體的比例沒有影響，但增加了未分化和分化的精原細胞標記早幼粒細胞白血病鋅指蛋白（promyelocytic leukemia zinc finger protein，PLZF）、c-kit和減數分裂后標記外密纖維蛋白 2（outer dense fiber protein 2，Odf2）在D5的基因和（或）蛋白的表達。用小干擾RNA敲除RLN可減少β-catenin在細胞連接處的表達，并將其表達轉移到細胞核，由此認為RLN可能通過調節精原細胞的自我更新和促進細胞接觸來影響精子發生。Feugang等[13]研究發現RLN主要聚集在睪丸的間質細胞中，在前列腺和精囊中含量較低；在曲細精管和附睪的管腔和上皮中也發現RLN表達；精子本身也存在RLN，且集中在頂體區，RXFP2比RXFP1分布更均勻。Braun等[14]報道RLN與RXFP1一起參與精子發生的第一階段，而RLN3通過與RXFP3結合參與了生精過程。此外，還觀察到 RLN、RLN3、RXFP1、RXFP2 和 RXFP3 mRNA的表達與睪丸中單倍體細胞的相對數量呈正相關。INSL3在睪丸各發育階段均有高表達。由于其受體RXFP2的低表達和非階段依賴性，INSL3在精子發生過程中不太可能具有自分泌和（或）旁分泌功能。在成人睪丸中，RLN、RXFP1和RXFP3的mRNA主要在睪丸管狀室表達，而INSL3在間質細胞表達較多。Heidari等[15]則通過不同劑量的RLN3培養正常的精液標本，發現RLN3可以減緩精子活力的自然下降，但沒有檢測到RXFP3 mRNA在精子中的表達，提示RXFP3在精子發生過程中停止表達。Yeganeh等[16]通過免疫熒光和RTPCR法，首次證實了RXFP4在精子中的存在，且集中分布在頸部和中段。INSL5則能抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）對線粒體的損傷，從而影響精子的發生、運動等。而目前INSL4只在胎盤上表達，在男性任何生殖道部位都未檢測到。Burnicka-Turek等[17]通過基因敲除小鼠研究表明，INSL6基因缺失的小鼠表現出明顯的精子發生中斷和減數分裂停滯，且INSL6在保護生殖細胞免受凋亡方面具有作用。

3 RLN對精子發生的作用機制

RLN介導多種生物學作用，包括纖維化、擴張血管、促血管生成、抗炎、抗凋亡和器官保護等作用[18]。在細胞水平上，RLN與受體RXFP1相結合，激活多種下游信號轉導通路。RLN通過復雜多樣的信號轉導機制在機體中發揮其多樣的生物學效應，包括環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）途徑、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑、蛋白激酶（protein kinase C，PKC）途徑和細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）途徑等。不同的細胞間，RLN誘導的信號轉導機制不完全相同[19]。在Sertoli細胞中，RLN主要通過ERK1/2及 PI3K/蛋白激酶 B（protein kinase，Akt）這兩條通路對精子發生產生影響。

3.1 PI3K/Akt及ERK1/2信號通路 PI3K/Akt信號通路參與細胞周期的調節，包括介導細胞存活、凋亡和增殖。McGuane等[20]通過使用PI3K抑制劑Y294002發現，通過RXFP1介導可快速激活PI3K的下游Akt。ERK1/2是MAPK家族成員，參與調節一系列細胞生物學過程，如細胞增殖和分化等。Nascimento等[21]研究發現，在大鼠原代培養Sertoli細胞中，RLN能在5～10 min內誘導ERK1/2快速磷酸化，在30 min內恢復到基礎水平。外源性RLN可增加Sertoli細胞數量和增殖細胞核抗原的表達。在大鼠Sertoli細胞中，絲裂素活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）抑制劑U0126阻斷了RLN引起Akt磷酸化的能力，而抑制PI3K則削弱了RLN治療增加ERK1/2磷酸化的能力。由此可見，ERK1/2和PI3K/Akt通路之間似乎也存在串擾。

3.2 促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）和RLN的相互作用 Sertoli細胞功能受多種激素調節，如FSH能調節其增殖及協助細胞間通訊，且有助其形成血-睪屏障。Soffientini等[22]研究表明FSH在決定嚙齒動物體內支持細胞增殖和細胞數量方面起著重要作用。FSH促進未成熟大鼠Sertoli細胞ERK1/2磷酸化和增殖，但在Sertoli細胞分化開始時抑制MAPK通路。一方面，PI3K/Akt/哺乳動物靶點雷帕霉素復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）通路也參與了FSH誘導的人髓細胞增生原癌基因（cellular myelocytomatosis oncogene，c-Myc）表達和 Sertoli細胞增殖，另一方面腺嘌呤核糖核苷酸（adenosine monophosphate，AMP）活化的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）的激活可能通過降低mTORC1活性和增加細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinases-1，CDK1）的表達而參與抑制Sertoli細胞的增殖[23-24]。然而，Nascimento等[25]通過研究FSH和RLN對15日齡大鼠Sertoli細胞增殖和分化相關的細胞內信號通路的影響發現，在支持細胞發育的這個時期，FSH通過激活c-AMP/環磷腺苷效應元件結合蛋白（CAMP response element binding protein，CREB），抑制ERK1/2和Akt通路，進而引導細胞分化。RLN通過抑制 cAMP和激活 ERK1/2、Akt、NF-κB來拮抗促性腺激素信號轉導，但不阻斷促性腺激素誘導的分化過程。

4 結語

Sertoli細胞在生精過程中的重要程度不言而喻。綜述RLN家族及其受體對Sertoli細胞功能調節的研究進展，為后續進一步實驗研究作用分子機制及臨床治療生精障礙提供了新思路。