實驗動物管腔內(nèi)皮損傷造模研究進展

環(huán)璐瑤，梁海燕，凌 斌

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029）

輸卵管妊娠約占異位妊娠的95%[1]，目前保守治療主要為取胚術(shù)，但該方法有輸卵管發(fā)生破裂的風(fēng)險，為保證患者的生命安全，多數(shù)情況只能采取輸卵管切除的方法，影響到生育能力[2～4]。輸卵管妊娠取胚術(shù)后輸卵管的損傷是目前臨床面臨的問題，其功能的恢復(fù)也亟待解決，因此建立一個相似的動物模型對于后續(xù)治療的研究至關(guān)重要。現(xiàn)針對國內(nèi)外常用的輸卵管損傷模型，同時結(jié)合體內(nèi)其他管腔（支氣管、血管）損傷的動物模型及特點，綜述如下。

1 輸卵管炎模型

輸卵管是盆腔炎癥性疾病的主要發(fā)病部位，輸卵管炎多由病原體感染引起，可分為內(nèi)源性和外源性2 類：內(nèi)源性病原體指陰道內(nèi)寄生的菌群，主要為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、溶血性鏈球菌等；外源性病原體包括沙眼衣原體（chlamydia trachomatis，Ct）、支原體、淋病奈瑟菌等[5]。基于輸卵管炎的發(fā)病機制，生物造模法應(yīng)運而生，根據(jù)病原體的選擇可將其分為特異性和非特異性。除生物法外，還有部分報道使用化學(xué)法也可成功獲得輸卵管炎模型[6]。

1.1 生物方法

1.1.1 特異性病原體

向動物輸卵管內(nèi)注入特異性病原體是目前國內(nèi)外最常用的輸卵管炎造模方法，Ct 則是最常用的病原體類型，Ct 感染后輸卵管組織出現(xiàn)纖維化改變，當病原體進入黏膜層上皮細胞后，以始體大量繁殖，并致黏膜層上皮細胞纖毛消失，破壞輸卵管蠕動及纖毛擺動功能，部分細胞核固縮、碎裂，明顯的纖維母細胞增生后導(dǎo)致組織纖維化，急、慢性炎癥細胞浸潤及纖維增生，從而導(dǎo)致輸卵管粘連以及盆腔炎癥[5]。Liao 等[7]用含1×107IFU 的MoPn 感染液50μl通過陰道內(nèi)接種感染，4 周后成功建立輸卵管炎模型。王柳苑等則[8]提出，不同基因型的Ct 對輸卵管的影響也存在差異，H 型和K 型Ct 感染小鼠后可能更容易逃避宿主生殖道黏膜上皮的免疫監(jiān)視和免疫反應(yīng)，進而導(dǎo)致更嚴重的輸卵管擴張積水、纖維組織增生、管腔變窄等。

1.1.2 非特異性病原體

向輸卵管內(nèi)注入細菌，主要通過其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶類引起炎性反應(yīng)，炎細胞浸潤、組織增生，從而引起炎性粘連，導(dǎo)致局部狹窄或擴張。根據(jù)病原體使用的類型數(shù)量可將其分為單一菌和混合菌。①單一菌：Li 等[9]將大腸埃希菌細菌原液用生理鹽水稀釋成濃度為3×108/ml 的大腸埃希菌混懸液，在建模后第15d 表現(xiàn)出典型慢性輸卵管炎特征；胡喜姣等[10]則是利用4×109/ml 金黃色葡萄球菌成功造模。②混合菌：將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌按2：1：1用無菌水稀釋，制成濃度為3×109/ml 的混合菌，于術(shù)后第20d 成功復(fù)制輸卵管炎模型[11]。使用細菌構(gòu)建輸卵管炎模型成功率較高，但要注意其接種的菌量，在輸卵管內(nèi)接種菌液量相對固定的條件下，菌液的濃度決定了動物感染的細菌量，濃度過低不易感染或感染率低，濃度過高易形成敗血癥，造成動物死亡。

1.2 化學(xué)方法

此類方法是通過向輸卵管內(nèi)注入化學(xué)制劑引起炎癥反應(yīng)進行造模，使用的制劑有苯酚膠漿及鹽酸，以上兩者皆為化學(xué)性腐蝕燒傷劑，苯酚膠漿曾經(jīng)在我國臨床上的輸卵管絕育手術(shù)中作為黏堵劑使用，將此類化學(xué)致炎劑注入輸卵管后會引起輸卵管管腔擴張、上皮細胞增生和炎性細胞浸潤，嚴重者可引起盆腔炎，因此也是制作盆腔炎模型的方法之一[6]。許浩等[6]向輸卵管緩慢注射25%苯酚糊劑0.02ml，15d 后造模成功。

雖然化學(xué)性燒傷致炎的病理結(jié)果與人類輸卵管炎一致，但兩者的感染途徑不同，并且此類方法可能會導(dǎo)致輸卵管嚴重損害甚至阻塞，目前已較少應(yīng)用。由此可見，在輸卵管炎模型的構(gòu)建中生物法能較好地模擬人生殖道感染過程，將病原微生物注入輸卵管內(nèi)的操作也接近人類輸卵管炎癥感染的途徑，在這種情況下建立的輸卵管炎癥模型也更具有信服力，更能真實地在動物體內(nèi)還原人類輸卵管炎癥的發(fā)生情況。

2 支氣管損傷模型

支氣管由3 層組織組成：①黏膜層上覆有黏膜，主要為假復(fù)層柱狀纖毛上皮細胞； ②黏膜下層為疏松結(jié)締組織，其中含有較多的氣管腺；③外膜由透明軟骨和纖維組織構(gòu)成。目前關(guān)于支氣管損傷的模型主要有慢性阻塞性肺疾病（chronic obstruct pulmonary disease，COPD）、支氣管狹窄及急性肺損傷（acute lung injury，ALI）等，常用的構(gòu)建方法可以根據(jù)性質(zhì)劃分為生物、物理及化學(xué)3 類：

2.1 生物方法

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌細胞壁中主要的促炎糖脂成分，將LPS 注入支氣管內(nèi)主要用來建立ALI 模型。LPS 的介入會導(dǎo)致肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞和肺基質(zhì)的急性彌漫性損傷，其實質(zhì)是肺內(nèi)各種炎癥細胞的激活和浸潤以及一系列炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致肺損傷。同時更多的炎癥細胞被激活，炎癥介質(zhì)或細胞被釋放，進一步放大和加強了肺損傷信號，形成炎癥瀑布效應(yīng)[12]，與ALI 臨床表現(xiàn)相似。也有研究表明，吸入途徑誘導(dǎo)的ALI 能更好地模擬人類疾病狀態(tài)。該模型具有時間周期短等優(yōu)點，但建模過程中需嚴格控制LPS用量，用量過大可能會造成支氣管內(nèi)皮不可逆性損傷。

2.2 物理方法

此類方法是通過機械力直接損傷支氣管內(nèi)皮，是建立支氣管狹窄動物模型的常用方法。陳思等[13]將SD 大鼠麻醉后，頸前區(qū)用脫毛膏被毛，以0.5%碘伏消毒，做長約3cm 的頸前區(qū)正中切口，鈍性分離頜下腺及氣管旁肌肉，左右兩側(cè)分別以彎頭止血鉗牽拉氣管旁肌肉以暴露喉和氣管，在距環(huán)狀軟骨0.4cm 處橫向切開氣管，切開2/3 周徑。從切口處向遠端伸入1.5mm 直徑硬質(zhì)尼龍刷來回刮刷10 次以刮除黏膜，摩擦區(qū)域長約1cm，可成功構(gòu)建支氣管狹窄動物模型。該方法能較好地模擬臨床上常見的繼發(fā)于插管或氣管切開等的黏膜機械損傷，但此模型也有一定的局限性，由于大鼠氣管管腔面積基數(shù)小，無任何治療的情況下肉芽組織在造模后d8 幾乎充滿管腔，導(dǎo)致氣道完全閉塞、動物窒息死亡。因此，該模型僅適用于狹窄早期階段（肉芽組織增生期）的研究[13]。

2.3 化學(xué)方法

在構(gòu)建COPD 的動物模型上，基于該病常見的危險因素 “吸煙”，研究者通過將動物暴露于煙草煙霧（cigarette smoking，CS）中模擬香煙損害氣管的機制[14，15]。氣道上皮細胞是CS 的主要靶細胞[16]，其破壞機制可能是：①CS 中含有大量的活性氧自由基（ROS），會導(dǎo)致肺部氧化應(yīng)激和損傷，ROS 到達肺部后觸發(fā)其他自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤；②CS 的暴露可以抑制內(nèi)源性抗蛋白酶的活性，并募集和激活肺泡巨噬細胞和中性粒細胞；③增加肺內(nèi)皮屏障的通透性，并導(dǎo)致內(nèi)皮細胞活化，氣管上皮纖毛密度顯著降低，部分脫落至完全脫落，上皮細胞空泡變性，典型結(jié)構(gòu)消失，同時也會導(dǎo)致肺內(nèi)皮細胞凋亡[17]。Magnani 等[14]將Wistar 大鼠放在1 個與吸煙裝置相連的干凈的房間里，每次放入5 只。每次向房間內(nèi)注入CS 30min，在第1 周，在早晨以5 支煙/30min/d（7d/周）的速度釋放；從第2 周開始，增加到10 支/30min，直到研究結(jié)束可成功建立COPD 模型。CS 誘導(dǎo)的模型是模擬COPD 最常見的模型，因為它們在生理上與人類疾病相似，但此方法也存在許多不足：首先是時間和能量消耗，造模周期較長；其次，由于同一刺激物的劑量、時間和動物品系可能會導(dǎo)致不同的結(jié)論，暴露方法沒有統(tǒng)一的標準。

3 血管內(nèi)皮損傷模型

3.1 物理方法

此種造模方法的根本機制是人為對血管內(nèi)皮層產(chǎn)生機械力，從而引起內(nèi)皮損傷或功能障礙，根據(jù)介入方式的不同可以分為手術(shù)損傷和藥物損傷，手術(shù)損傷是通過球囊或金屬絲直接拉傷并剝脫內(nèi)皮，藥物損傷是通過藥物升高動物血壓，高血壓使血管壁承受的血液流體力學(xué)發(fā)生改變，引起血管壁的病理改變，并影響血管內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)與功能，反過來，內(nèi)皮功能障礙又加重了高血壓的發(fā)展，形成惡性循環(huán)。

3.1.1 手術(shù)損傷

王學(xué)寧等[18]將Si Pham 教授前期經(jīng)驗改進，對球囊進行充水排水試驗；大鼠麻醉后，碘伏消毒，紗布鋪單顯露手術(shù)部位：于腹部正中做一約4cm 縱切口，撐開腹壁及腹膜，用棉簽及鑷子鈍性分離腹主動脈及雙側(cè)髂動脈，分別在腹主動脈發(fā)出腎動脈后及分為左、右髂動脈前，各穿1 根1號慕絲線以便提拉腹主動脈；皮下注射肝素300U/kg，輕提2 處牽線并分別用微創(chuàng)動脈夾鉗夾腹主動脈，用尖刀在兩動脈之間的腹主動脈前壁做一長約2mm 縱行切口；用鑷子輕夾球囊桿部將球囊插入動脈切口，開放遠端血管夾，將球囊向遠處推送，利用牽線將球囊經(jīng)過髂動脈分叉導(dǎo)入左髂動脈，推至遇阻力不能繼續(xù)前進時停止；助手將球囊注水使其膨脹，并維持壓力為1.5 個大氣壓（1 個標準大氣壓=101.325kPa），術(shù)者將球囊緩慢回拉，直至退入腹主動脈內(nèi)，助手將球囊排水，術(shù)者再次上述方法將球囊插入至左髂動脈以遠；如此重復(fù)3 次；損傷完畢，將球囊緩慢撤出至切口附近，用微創(chuàng)血管夾阻斷遠端腹主動脈，再將球囊完全撤出，可成功構(gòu)建血管內(nèi)皮損傷模型。也有學(xué)者[19]通過電刺激成功建立模型。通過機械力使血管靶段內(nèi)皮層徹底剝脫，是目前應(yīng)用最多的動物模型。此外，這種方法還具有可逆性、血栓形成率低、死亡率低及術(shù)后總體情況良好等優(yōu)點。但操作難度較大，手術(shù)過程中容易在分離動脈時碰傷周圍的靜脈血管而引起大出血；不論是球囊拉傷還是電刺激損傷都難以控制血管損傷的程度，對術(shù)者要求較高。

3.1.2 藥物損傷

藥物損傷是通過藥物的介入升高動物血壓對血管壁形成生物機械力，損傷血管內(nèi)皮，Wei 等[20]使用腎上腺素構(gòu)建血管內(nèi)皮損傷模型，于每日10 點、14 點及18 點皮下注射稀釋的鹽酸腎上腺素（0.67mg/ml，0.5ml/kg），14d 后可成功建模。其機制可能是：①腎上腺素具有強烈的血管收縮作用，皮下注射腎上腺素導(dǎo)致血壓升高，而急劇的血壓升高則會產(chǎn)生機械損害，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞通透性增加、形態(tài)及數(shù)量異常等血管壁損傷；②腎上腺素的誘導(dǎo)以及血管內(nèi)皮細胞的損害可以引起腎素-血管緊張素系統(tǒng)失衡，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）分泌增加，而AngⅡ可增加血管內(nèi)皮細胞的通透性，促進脂質(zhì)沉積和有害物質(zhì)的侵襲，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞功能受損，AngⅡ還可通過NF-κB 途徑加重血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷[21]。該造模方法與人體因高血壓引起血管內(nèi)皮損傷的機制相似，且具有操作簡單、成功率高、同一性強等優(yōu)點，是研究高血壓相關(guān)血管疾病的理想動物模型。

3.2 化學(xué)方法

該建模方法的機理是利用同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）誘導(dǎo)血管內(nèi)膜變性、脫落，主要用于模擬人類的動脈硬化狀態(tài)。Hcy 是一種含硫的血管損傷氨基酸，在體內(nèi)是甲硫氨酸循環(huán)的代謝產(chǎn)物，也是許多甲基化反應(yīng)及能量代謝過程中一種重要的中間物質(zhì)[22]。其損傷機制可能是：①產(chǎn)生ROS，進而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，降低膜流動性，破壞細胞完整性，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞凋亡或死亡[23]；②增加血小板的聚集率及黏附性，導(dǎo)致血栓形成，促進AS 的發(fā)展。國外學(xué)者研究證明，Hcy 是動脈內(nèi)膜增厚和粥樣斑塊形成的獨立危險因[24]。所以應(yīng)用Hcy 制作動物模型，能成功模擬人類因AS 導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷狀態(tài)，目前應(yīng)用較為廣泛。

4 結(jié)語

通過對3 種管腔內(nèi)皮損傷模型的歸納總結(jié)可以發(fā)現(xiàn)，動物模型的建立無外乎生物、物理、化學(xué)3 種方法，而每種方法的建立都是基于所要研究疾病的病因、發(fā)病機制及病理特征等，以達到最大程度模擬人類疾病狀態(tài)的效果。