利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術聯合T細胞斑點試驗對泌尿系結核的診斷效果評價

吳素方，梁麗麗，鄭淑蘭，劉新

作者單位：河南省胸科醫院結核科，河南 鄭州450003

泌尿系結核（urinary tuberculosis，UTB）是一種較嚴重的肺外結核類型，其發病率約占結核病的4%，在肺外結核病人中其發病率30%～40%［1］。UTB起病隱匿，臨床表現具有多樣性，可表現為呈腰部疼痛、午后低熱、尿急、尿頻、尿痛、乏力、排尿不適等，其臨床癥狀通常在疾病晚期出現，常導致診斷的延誤，進而引起泌尿系統器官的損毀［2］，UTB的臨床表現特點，突顯了早期快速診斷的重要性。目前，結核病診斷的“金標準”是細菌學檢查，但是由于UTB病人的尿液標本分枝桿菌培養需時長，且陽性率低，不能滿足臨床早期快速診治的需要；傳統涂片鏡檢抗酸涂片假陽性率較高，結果往往不可靠。因此，迫切需要能夠快速準確檢測結核分枝桿菌復合群的新方法。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（GeneXpert MTB/RIF，簡稱Xpert）是一種全新的分子診斷技術，具有較高的診斷靈敏度［3-4］；結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT）具有快速簡便、特異性高的特點［5-7］。近年來，使用兩種方法用于肺結核診斷的文獻報道很多，但少有聯合用于肺外結核診斷的比較研究。本文主要探討Xpert聯合T-SPOT對UTB診斷效能的評價，旨在為UTB早期診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年1月至2018年12月河南省胸科醫院就診，臨床疑似UTB病人89例。病人入組條件為具有尿急、尿頻、尿痛、排尿不適、血尿、腰痛、乏力等臨床癥狀或尿常規檢查異常病人。所有接受抗結核藥物治療不足1個月，未進行泌尿系手術治療。所有病人HIV檢測陰性。

病人的人口學信息及臨床特征（如性別、年齡、病史、并發癥、泌尿系統器官累及的范圍及病變形式）等內容均來源于臨床原始病史記錄，臨床資料完整。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 UTB病人的臨床診斷依據和排除標準BACTEC MGIT 960分支桿菌培養陽性；典型的臨床表現、實驗室尿常規檢測、結核菌素試驗、結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT）等相關檢查有陽性結果、泌尿系影像學表現、膀胱鏡活檢病理檢查有結核、抗結核藥物治療反應良好。臨床診斷為非UTB的依據為：病人沒有結核分枝桿菌培養、影像學、病理學等其他結核方面證據，并且抗結核藥物治療無效者。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣本采集 收集每例病例24 h尿沉渣標本至少5 mL，每份標本進行涂片查抗酸桿菌、MGlT 960分枝桿菌培養和Xpert檢測。同時取病人靜脈血5mL，肝素抗凝，進行T-SPOT檢測。

1.3.2 尿液標本涂片查抗酸桿菌 一次性吸管吸取少許無菌標本采集管中的尿液標本涂于載玻片上進行熒光染色（珠海貝索生物有限公司），置光學顯微鏡下（Olympus，日本）觀察計數，以每50個視野抗酸桿菌≥3條為陽性。

1.3.3 液體培養 取2 mL尿液標本用于培養，使用MGIT 960分枝桿菌液體培養系統（BD，美國）按照操作說明書進行。液體培養時間設定為42 d。儀器自動報告陽性后，取培養液涂片鏡檢，若查到抗酸桿菌則為陽性；若未見抗酸桿菌則為陰性。

1.3.4 Xpert檢測 取1 mL尿液標本與標配處理液常規按1∶2比例混合，旋緊管蓋，渦旋振蕩15-30 S，室溫靜置15 min，使標本充分液化。吸取2 mL液化的標本至Xpert反應試劑盒，置于Xpert檢測系統（Cepheid，美國），儀器開始進行自動化檢測。約2 h反應結束后，在檢測系統窗口下可直接觀察測試結果判讀檢測結果，結果根據探針循環閾值（Ct值）判斷［5］。當內對照探針Ct值≤38視為陽性，對照探針Ct值＞38視為陰性；如果讀出結果顯示“invalid”“error”“no result”時，若樣本足夠時應重復檢測一次。

1.3.5 T-SPOT試驗 采集病人空腹靜脈血5 mL，肝素抗凝，加入淋巴細胞分離液離心，分離外周血單個核細胞，洗滌與計數后制備成工作濃度細胞懸液，將工作懸液和結核特異抗原加入預包被有干擾素-γ（IFN-γ）抗體反應孔中，37 ℃、5%二氧化碳孵育過夜，洗滌微孔板加入酶標抗體，洗滌微孔板加入底物反應液，記錄斑點形成細胞數。結果判讀：當陰性對照孔斑點數0-5，ESAT-6或CEP-10抗原孔斑點數-陰性對照孔斑數點數≥6時，則為陽性；當陰性對照孔斑點數≥6時，孔斑點數≥2倍陰性對照斑點數時，則為陰性。

1.3.6 靈敏度和特異度的計算 以臨床診斷為標準。靈敏度＝真陽性例數／（真陽性例數+假陰性例數）×100%；特異度＝真陰性例數／（真陰性例數+假陽性例數）×100%。

2 結果

2.1 一般情況和檢測結果 共計91例病例符合納入條件，其中2例為HIV感染者，最終進行數據分析的病例數為89例。其中42例（47.1%）病例臨床確診為UTB，UTB病人中分枝桿菌培養陽性18例（42.8%）；其余24例（57.1%）以典型臨床表現、泌尿系相關影像學表現、膀胱鏡活檢病理結果、及抗結核藥物治療有效等作為診斷依據。47例（52.8%）病例被臨床診斷為非泌尿系結核。見表1。

表1 臨床疑似UTB病人89例臨床檢測結果的比較/例（%）

UTB病例的臨床資料顯示，其病程較長，一般1.5～3年，在各個年齡段均有發病，但以老年男性居多。病人通常合并有尿常規的異常比例升高，臨床表現更多地表現為尿頻、尿急、夜尿增多等儲尿期癥狀及腰痛明顯；同時伴有嚴重的腎臟破壞，更易并發腎盂積液，輸尿管增厚、狹窄或擴張，膀胱攣縮等癥狀。與非UTB病人相比，病人同時合并有生殖系統結核及慢性腎臟疾病的比例升高。

2.2 Xpert聯合T-SPOT診斷UTB的靈敏度和特異度 以臨床診斷作為金標準，抗酸桿菌涂片、液體培養、Xpert和TSPOT以及Xpert+TSPOT聯合檢測的靈敏度和特異度，見表2。

表2 臨床疑似UTB病人89例5種檢測方法的靈敏度和特異度比較/例（%）

抗酸桿菌涂片的靈敏度為11.8%，顯著低于液體培養的靈敏度42.8%（χ2＝21.215，P＜0.001）。T-SPOT的特異性為74.4%，顯著低于抗酸桿菌涂片的特異度95.7%（χ2＝11.255，P＜0.01）。T-SPOT的靈敏度為 85.7%，顯著高于 Xpert的靈敏度（χ2＝15.321，P＜0.01）。

Xpert+T-SPOT聯合檢測的特異度為100%，靈敏度為89.4%，顯著高于抗酸涂片（χ2＝57.225，P＜0.001）、液體培養法（χ2＝19.112，P＜0.001）、Xpert檢 測（χ2＝7.823，P＜0.01）和 T-SPOT 檢 測（χ2＝2.573，P＜0.05）。

3 討論

UTB起病隱匿，泌尿系統的損傷呈漸進性發展，早期臨床表現的缺乏和非特異性常導致診斷的延誤。這對臨床上UTB的診斷提出了挑戰。Xpert是世界衛生組織（WHO）推薦的遏制結核病的檢測方法［8-9］，于2013年又推薦用于肺外結核的診斷［10］。近年來的多項研究表明，Xpert用于肺結核的診斷均有較高的靈敏度和特異性，但對肺外結核的診斷研究并不多。Bahr等［11］證實了應用Xpert檢測腦脊液標本診斷結核性腦膜炎的靈敏度達72.0%（13/18），遠高于腦脊液抗酸桿菌涂片靈敏度（27.8%，5/18；P＝0.008），與結核分枝桿菌培養靈敏度相似71.2%（12/17），但培養法造成了27d的診斷延誤。王桂榮和黃海榮［12］應用Xpert技術通過檢測骨關節結核部位的膿液標本證實了此項技術快速診斷骨關節結核的高靈敏度（82.0%，41/50）和高特異度（100.0%，10/10），并證實了Xpert檢測利福平耐藥的靈敏度和特異度均為100.0%。本研究中，Xpert檢測的靈敏度為64.2%，較低于以上研究結果，考慮可能與尿液結核菌含量較低、Xpert檢測方法檢測限值有關。

T-SPOT通過結核分枝桿菌特異性抗原多肽刺激T淋巴細胞分泌IFN-γ，與微孔板IFN-γ抗體結合，通過顯色反應后形成色素沉淀斑點，達到診斷結核感染的目的［13-14］，是一項檢測血清干擾素-γ（IFN-γ）、抗原特異T淋巴細胞極為敏感的技術，且不會受到T淋巴細胞數量、卡介苗和非結核桿菌的影響，即使在免疫功能低下的人群中，T-SPOT的靈敏度仍然較高［15-17］。本研究中血清T-SPOT檢測的靈敏度為85.7%（36/42），特異度為74.4（35/47），且在臨床診斷為UTB，而在涂片、培養及Xpert均為陰性的病人中T-SPOT的陽性率為81.3%（26/32）彌補了UTB病原學檢測靈敏度低的問題。本研究結果顯示T-SPOT在非UTB病人中的陽性率達到25.5%，顯著高于其他方法，究其原因是由于其對潛伏性結核感染的靈敏度較高，我國是結核高負擔國家，人群中潛伏性結核感染率較高，這就是導致T-SPOT檢測特異度不高的原因。

在臨床診斷UTB病人中，Xpert聯合T-SPOT檢測的靈敏度為89.4%（38/42），特異度為100%（47/47），其靈敏度及特異度顯著大于抗酸涂片，液體培養，Xpert檢測以及T-SPOT檢測，兩者的聯合使用既彌補了Xpert的靈敏度不足也能夠彌補T-SPOT特異度不足的缺陷，且用時更短。UTB的早期臨床表現的隱匿性和不典型性，使其診斷較為困難，因此，盡早對可疑病人進行Xpert聯合T-SPOT檢測，能及早發現結核病的診斷依據并進行鑒別診斷，從而能夠選擇合適的抗結核治療方案治愈UTB病人，避免腎功能損害及后遺癥。此兩種方法的聯合檢測對于UTB的臨床診斷有著非常好的臨床應用價值，值得廣泛推廣應用。但是由于此兩種方法的實驗室條件要求較高，在基層醫院開展尚存在一定困難，因此簡易便攜的實驗儀器和試劑是重要的研發方向。

在檢測方法的比較研究中，病例的選擇、樣本的采集、檢測試劑的廠家以及操作人員等都是可能的影響因素，因此有必要開展更嚴謹、人群規模更大的研究。