斯鈣素-2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)

付長紅，陸曉媛

作者單位：1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 徐州221001；2棗莊市立醫(yī)院婦科，山東 棗莊277101

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）為子宮內(nèi)膜上皮來源的惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)中常見的三大惡性腫瘤之一。絕大多數(shù)的子宮內(nèi)膜癌來源于單層上皮細(xì)胞。目前發(fā)現(xiàn)有多種因素影響到子宮內(nèi)膜的惡變、進(jìn)展，包括有不同的癌基因、抑癌基因及轉(zhuǎn)錄信號，如甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（TTF-1）、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、骨橋蛋白等通過參與細(xì)胞黏附、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等多種病理生理過程，與內(nèi)膜癌的發(fā).生有著一定的聯(lián)系。斯鈣素-2（stanniocalcin2，STC2）是糖蛋白激素［1］，在人體各組織中均有廣泛性表達(dá)，參與調(diào)節(jié)人體多種生理、病理變化過程。近年來對STC2的系列研究證明，STC2對人體多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均存在密切關(guān)聯(lián)［2］。STC2能夠通過調(diào)控細(xì)胞增殖而促進(jìn)結(jié)腸、直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［3］。胃癌病人的血液、癌組織細(xì)胞中的STC2表達(dá)明顯升高［4］，對胃癌診斷的敏感性超過了CA199［5］和 CEA。食管鱗癌、肝癌［6］、喉癌、卵巢癌［7］、非小細(xì)胞性肺癌、鼻咽癌［8］、前列腺癌、宮頸癌［8］、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤均發(fā)現(xiàn)存有STC2異常表達(dá)。以上研究發(fā)現(xiàn)：STC2在組織中的高表達(dá)多與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，腫瘤傾向于深度浸潤、脈管侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對預(yù)測腫瘤療效或預(yù)后提示價(jià)值。

目前，關(guān)于STC2在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)的研究報(bào)道較少，我們采用半定量RT-PCR檢測和蛋白質(zhì)印跡法檢測方法觀察STC2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)，探討STC2與子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2017年1月至2018年9月的子宮內(nèi)膜癌病人50例，年齡范圍為45～62歲，年齡（53.8±5.6）歲，其中＞50歲的病人32例，占64%；FIGO分期為Ⅰa期5例，占10%，Ⅰb期8例，占16%，Ⅱ期10例，占20%，Ⅲ期20例，占40%，Ⅳ期7例，占14%；病理類型為鱗癌5例，占10%，腺癌45例，占90%，其中腺癌45例中，病理呈高分化有15例，占33%，中分化16例，占36%，低分化的14例，占31%；盆腔淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的27例，占54%，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移的23人，占46%。所有樣本均于手術(shù)離體后癌灶中心組織及癌灶周圍3 cm的正常組織，生理鹽水沖洗后切取，約為花生粒體積大小。為避免取樣組織被RNA酶破壞，獲得樣品在組織離體后的10 min內(nèi)裝入凍存管。

1.2 方法

1.2.1 半定量RT-PCR檢測STC2 mRNA在中的表達(dá) 取50～100 mg子宮內(nèi)膜癌組織研磨均化，4℃下離心分層出STC2 mRNA。再將mRNA沉淀、洗滌、重溶、-80℃超低溫保存。抽提處于對數(shù)快速生長期的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，使用Trizol與組織RNA抽取類似，收集提取樣本總RNA。采用DNase I處理去除基因組DNA。每個樣本取2 μg的總RNA，用M-MLV Reverse Transcriptase二步法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以Taq酶體系PCR擴(kuò)增STC2基因，引物序列：STC2：F-ATGCTACCTCAAGCACGACCFF，R-TCTGCTCACACTGAACCF；GAPDH：F-FTGTTCGACACTCCTCCGTCAGCFF，R-FCAAATCCCCCAATACGACGTT。PCR條件均為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共34循環(huán)（β-actin為29循環(huán)）；72℃延伸5 min。取出擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物，以β-Actin作為內(nèi)對照，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法法檢測STC2蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá) 取200 mg子宮內(nèi)膜癌樣品及周圍正常組織分別粉碎勻漿、離心，取上清液-80℃超低溫冰箱保存。配置濃度為2 000 μg/mL和1 600 μg/mL的BSA溶液設(shè)為A液B液，按照50∶1混勻，各取100 μL分別和5 μL正常組織蛋白及5 μL內(nèi)膜癌樣品蛋白混勻，對蛋白定量繪制蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣品濃度。配置5%濃縮膠，取兩種樣品沸水加熱使蛋白質(zhì)變性、上樣、電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法檢測后用聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜與兔抗人STC2抗體封閉進(jìn)行免疫反應(yīng)約7 h。取出PVDF膜X光底片顯色，拍照成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)量資料用s表示，兩組間均值比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織STC2 mRNA的表達(dá)增加在這50例子宮內(nèi)膜癌組織中STC2 mRNA的相對表達(dá)值為2.45±0.27，而癌旁組織僅為1.19±0.13，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝28.5，P＝0.0034）。

2.2 子宮內(nèi)膜癌中STC2蛋白表達(dá)增加 在50例子宮內(nèi)膜癌組織中STC2蛋白表達(dá)和癌旁組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝26.4，P＝0.026 6），見圖1及表1。

圖1 子宮內(nèi)膜癌病人50例子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織中STC2蛋白的表達(dá)

表1 子宮內(nèi)膜癌病人50例子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)印跡法條帶灰度值檢測結(jié)果/s

表1 子宮內(nèi)膜癌病人50例子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)印跡法條帶灰度值檢測結(jié)果/s

注：STC2為斯鈣素-2，GAPDH為內(nèi)參值；兩組比較，at＝26.4，P＝0.026 6

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2.3 與子宮內(nèi)膜癌各項(xiàng)臨床病理參數(shù)的相關(guān)性本研究對50例樣本中STC2的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌病人臨床病理參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析。計(jì)算結(jié)果顯示，在病人年齡（≤50歲或＞50歲）、病理類型腺癌（鱗癌）方面，STC2高表達(dá)組與低表達(dá)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；關(guān)于FIGO分期＞Ⅱ期、病理為低分化癌及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者［10］，STC2的高表達(dá)組與低表達(dá)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是嚴(yán)重危及女性生命健康的惡性腫瘤。目前子宮內(nèi)膜癌的診治方案［11］比較成熟，經(jīng)過規(guī)范的手術(shù)輔以放化療和孕激素綜合治療，病人通常能夠取得較滿意的治療效果［12］。隨著人類對腫瘤研究的不斷深入和臨床運(yùn)用，腫瘤標(biāo)志物已不單單局限于對腫瘤的診斷、復(fù)查和隨訪，在治療方案的選擇、療效的判定、存活率的預(yù)測等方面也逐漸發(fā)揮著重要作用［13］。較常用的腫瘤標(biāo)志物有CEA、CA199、CA125等，對于子宮內(nèi)膜癌的術(shù)前病理分期診斷的幫助、治療方案的指導(dǎo)及術(shù)后病情監(jiān)測等方面敏感性較低。尋找子宮內(nèi)膜癌新的、特異性的腫瘤標(biāo)志物是研究的熱點(diǎn)。

表2 斯鈣素-2表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性/例

STC2是1998年從人類骨肉瘤cDNA文庫中克隆出的第二個STC基因，其編碼為302個氨基酸。多項(xiàng)研究顯示STC2 mRNA和STC2蛋白在腫瘤組織中高表達(dá)［14］，及腫瘤組織的侵襲、病人預(yù)后等存在相關(guān)性［15］。STC2目前在腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚，但研究表明在許多腫瘤中發(fā)揮促癌細(xì)胞生長增殖、促癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用［16］。高表達(dá)多與腫瘤的惡性度相關(guān)，并有較好的預(yù)后提示價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織的STC2 mRNA及STC2蛋白表達(dá)明顯高于相應(yīng)癌旁組織。腫瘤的相關(guān)性分析顯示子宮內(nèi)膜癌病人多項(xiàng)臨床的病理參數(shù)中，STC2表達(dá)與年齡［17］、鱗癌無顯著相關(guān)性（P＞0.05）；但是與FIGO分期、病理分化程度及盆腔淋巴轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)。本次研究的27例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌病人中，STC2陽性表達(dá)率為70.37%；病理呈中低分化的STC2陽性表達(dá)為88.24%。故FIGO分期高，病理呈低分化，存在盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，均提示子宮內(nèi)膜癌侵襲能力較強(qiáng)，腫瘤復(fù)發(fā)可能性大和預(yù)后的生存期短，故高表達(dá)的STC2間接預(yù)示病人預(yù)后不良。

綜上，本研究顯示STC2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)高于其癌旁組織，且與子宮內(nèi)膜癌的病理分期，病理分化程度及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定關(guān)聯(lián)性，提示病人可能存在不良的預(yù)后。本研究樣本量少，有一定的局限性，且對STC2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)相關(guān)性及其機(jī)制也尚待進(jìn)一步研究。