miR-29a對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響

郭雄飛，王 挺，湯立新

(河南省南陽市中心醫(yī)院 鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院 骨科, 河南 南陽 473000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜炎為主要特點的系統(tǒng)性慢性自身免疫性疾病，致殘率高[1]。RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及滑膜細(xì)胞、T細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，其中成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)是臨床上RA反復(fù)發(fā)作、久治不愈和預(yù)后不良的一個主要原因，已被認(rèn)為是一類“類腫瘤樣”細(xì)胞[2]。因此，研究FLS已成為RA治療的重點。microRNA(miRNA)是一類在進(jìn)化上保守的長度約18～22 nt的非編碼RNA，在真核生物中普遍存在，可通過與靶mRNA的3′UTR結(jié)合，通過降低靶mRNA后抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯，調(diào)節(jié)蛋白生成，從而發(fā)揮效應(yīng)。已有多項研究表明，miRNA與自身免疫性疾病如RA密切相關(guān)[3]。miR-29a是miRNA大家族成員之一，有研究表明，RA中miR-29a下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)miR-29a可通過靶向STAT3抑制FLS增殖和誘導(dǎo)凋亡，但其作用機(jī)制研究的尚未明確[4]。活化T細(xì)胞核因子5(nuclear factor of activated T cells 5，NFAT5)是廣泛存在的一個與滲透壓有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，有研究表明，RA滑膜中NFAT5高表達(dá)，抑制NFAT5表達(dá)可降低RA滑膜增殖和血管生成[5]；巨噬細(xì)胞NFAT5表達(dá)可促進(jìn)慢性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[6]。miR-29a是否可調(diào)節(jié)NFAT5影響FLS增殖和凋亡尚未清楚。因此，本研究旨在探討miR-29a是否可靶向抑制NFAT5影響FLS增殖和凋亡，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本：RA滑膜組織取自湖北省荊州市中心醫(yī)院關(guān)節(jié)外科進(jìn)行膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的RA患者。健康人滑膜組織取自因外傷行關(guān)節(jié)手術(shù)的患者。所有樣本的采集經(jīng)過患者的知情同意，并簽訂知情同意書及通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(19NYZX025)。RA患者的臨床診斷均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 試劑及試劑盒：DMEM培養(yǎng)基和FBS(Gibco公司)；MTT和DMSO(Sigma-Aldrich公司)；miR-29a mimics、anti-miR-29a、si-NFAT5、對照片段(廣州銳博技術(shù)有限公司)；RT-qPCR試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司)；NFAT5、p38、p-p38和cleaved-caspase3抗體(CST公司)；細(xì)胞凋亡試劑盒(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 FLS的原代分離培養(yǎng)：無菌條件下取滑膜組織，PBS浸泡及沖洗后，用眼科剪將滑膜附屬的多余外周組織除去，并將組織剪成小塊(2 mm×2 mm×2 mm)，PBS再次沖洗，將組織塊移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部朝上，于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，在培養(yǎng)瓶中加入3 mL含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞匯合度達(dá)90%時，將組織小塊轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。對留在培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，根據(jù)實驗需要進(jìn)行傳代。健康人化膜組織來源的FLS標(biāo)記為n-FLS,RA患者來源的FLS標(biāo)記為RA-FLS。實驗所用細(xì)胞為3代～6代。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達(dá)：適量蛋白裂解液提取n-FLS和RA-FLS總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。按照50 μg蛋白樣品與上樣緩沖液4∶1比例混勻，于100 ℃沸水中變性5 min。配置5%濃縮膠和12%分離膠，經(jīng)SDS-PAGE分離、電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，將膜置于5%蛋白封閉液中1 h，TBST洗膜，加稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加稀釋好的HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例1∶3 000)，于37 ℃搖床振蕩封閉1 h，洗膜，將ECL顯色液滴加到PVDF膜上，在暗盒中使用X線膠片曝光。拍照。Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值為各蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染；以5×104個/孔接種3代～6代的RA-FLSs于12孔板，于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育16～24 h，當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%～80%融匯度時，參照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別制備miR-NC、miR-29a mimics(簡稱miR-29a)、anti-NC、anti-miR-29a、si-NC、si-NFAT5及miR-29a+pcDNA5-NFAT5與LipofectamineTM2000復(fù)合物，將復(fù)合物加入6孔板相應(yīng)孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實驗。

1.2.4 RT-qPCR檢測基因表達(dá)：收集RA-FLSs，加適量的Trizol裂解，提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計對RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。取300 ng總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)引物設(shè)計原則，用Premier5.0軟件設(shè)計miR-29a及NFAT5引物，送由上海吉瑪生物公司合成。以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，根據(jù)PCR試劑盒說明制備反應(yīng)體系及設(shè)置反應(yīng)條件。通過美國Thermo熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。每孔設(shè)置6個復(fù)孔。以所得Ct均值，通過2-△△Ct公式計算miR-29a和NFAT5 mRNA相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗：根據(jù)Targetscan等靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)miR-29a與NFAT5的 3′UTR存在結(jié)合位點。根據(jù)NFAT5基因的3′UTR區(qū)序列設(shè)計并合成PCR引物。用T4 DNA連接酶將miR-29a全長片段與pcDNA5空載體連接，NFAT5全長片段與pcDNA5載體連接。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)大腸桿菌，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒DNA、酶切及測序驗證。將預(yù)測的與成熟miR-29a mRNA 結(jié)合的NFAT5 mRNA 3′UTR區(qū)域野生型(WT)及突變型(MUT)的特定序列插入到pGL3-Promoter-Vector載 體 里，構(gòu)建出pGL3-NFAT5 3′UTR-WT 和pGL3-NFAT5 3′UTR-MUT 2個質(zhì)粒，并用LipofectamineTM2000試劑將其轉(zhuǎn)至RA-FLSs。按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明進(jìn)行檢測熒光素酶活性。各組細(xì)胞的相關(guān)熒光強(qiáng)度=螢火蟲熒光強(qiáng)度/海腎熒光強(qiáng)度。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞活力檢測：取對數(shù)增殖期的RA-FLSs接種于96孔板，每孔200μL(約2×104個細(xì)胞)，加miR-29a mimics、si-NFAT5及miR-29a+NFAT5，培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄掉上清，每孔中加150 μL的DMSO，搖床上低速振蕩10 min，以使結(jié)晶能夠溶解充分。酶標(biāo)儀測定490 nm波長測定吸光度值(A值)。每孔設(shè)置5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測 miR-29a mimics、si-NFAT5及miR-29a+NFAT5轉(zhuǎn)染RA-FLSs 48 h后，收集細(xì)胞。按照annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒說明檢測細(xì)胞凋亡。具體操作如下：預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加1 mL 1×annexin V-FITC結(jié)合緩沖液，離心，去上清，再加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再分別加入10 μL annexin V-FITC及5 μL PI，輕柔混勻，室溫避光孵育30 min，通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FLS標(biāo)志物檢測

與n-FLS比較，RA-FLSs中CHI3L1表達(dá)明顯升高(P<0.05)(圖1)。

2.2 過表達(dá)miR-29a對RA-FLS活力和凋亡影響

miR-29a mimics轉(zhuǎn)染RA-FLSs后，細(xì)胞中miR-29a mRNA表達(dá)明顯升高，細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率明顯升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 抑制NFAT5對RA-FLS活力和凋亡影響

NFAT5的特異性siRNA轉(zhuǎn)染RA-FLSs后，NFAT5 mRNA表達(dá)明顯降低，細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率明顯升高(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with n-FLS

A.relative expression of miR-29a mRNA after miR-29a mimics were transfected into RA-FLS; B.RA-FLS activity after miR-29a over-expression; C,D.apoptosis rate of RA-FLS after miR-29a over-expression;*P<0.05 compared with blank group

圖2 過表達(dá)miR-29a對RA-FLS活力和凋亡影響

2.4 過表達(dá)miR-29a或抑制NFAT5對RA-FLS中p38MAPK信號通路影響

與空白組相比，過表達(dá)miR-29a或抑制NFAT5均可下調(diào)p-p38表達(dá)，上調(diào)cleaved-caspase3表達(dá)(P<0.05)(圖4)。

2.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-29a靶基因

RA-FLS中 miR-29a與野生型NFAT5 3′UTR共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性明顯降低，而anti-miR-29a與野生型NFAT5 3′UTR共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性明顯升高(P<0.05)。過表達(dá)miR-29a可明顯下調(diào)NFAT5表達(dá)，抑制miR-29a表達(dá)可明顯上調(diào)NFAT5表達(dá)(P<0.05)(圖5)。

2.6 miR-29a靶向NFAT5對RA-FLS活力和凋亡影響

過表達(dá)miR-29a可明顯抑制RA-FLS活力，誘導(dǎo)RA-FLS凋亡，而過表達(dá)NFAT5可減弱過表達(dá)miR-29a對RA-FLS活力和凋亡的影響(P<0.05)(圖6)。

A.relative expression level of NFAT5 mRNA after si-NFAT5 was transfected into RA-FLSs; B.RA-FLS activity after inhibition of NFAT5 expression; C，D.apoptosis rate of RA-FLS after inhibition of NFAT5 expression；*P<0.05 compared with blank group

圖3 抑制NFAT5對RA-FLS活力和凋亡影響

A.protein expression bands; B.relative expression levels of p38, p-p38 and cleaved-caspase3 proteins;*P<0.05 compared with blank group

圖4 過表達(dá)miR-29a或抑制NFAT5對RA-FLS中p38MAPK信號通路的影響

3 討論

近年來，由于關(guān)節(jié)炎治療技術(shù)的提升，RA患者預(yù)后有了明顯的改善，多數(shù)患者病情得到較好的控制，但仍有部分患者治療效果不佳[7]。RA關(guān)節(jié)破壞的主要原因是關(guān)節(jié)滑膜過度增殖，因此，闡明RA滑膜細(xì)胞生物學(xué)特性及影響機(jī)制對于RA治療具有重要意義。miRNA是一類非編碼的小分子RNA，廣泛參與各種生理病理過程的調(diào)控，在RA發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用[8]。研究顯示，敲除miR-29a可引起骨關(guān)節(jié)炎患者FLS中III型膠原、TGF-β1、MMP9和ADAMTS5的高表達(dá)，此外，miR-29a靶向VEGF降低骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜的血管生成[9]；過表達(dá)miR-29a可靶向STAT3抑制骨關(guān)節(jié)炎患者FLS增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[4]。本研究檢測了健康人FLS(n-FLS)和RA患者FLS(RA-FLS)中標(biāo)志蛋白CHI3L1的表達(dá)，結(jié)果顯示，RA-FLS中CHI3L1蛋白表達(dá)明顯增加，提示RA患者滑膜組織塊分離得到了FLS。過表達(dá)miR-29a明顯抑制了RA-FLS活力，并誘導(dǎo)其凋亡，與既往研究結(jié)果一致，表明miR-29a參與調(diào)控RA-FLS增殖和凋亡。

A.targeting relationship between miR-29a and NFAT5 were detected by dual luciferase report assay; B,C.the expression of NFAT5 protein after over-expression of miR-29a or inhibition of NFAT5;*P<0.05 compared with miR-NC group;#P<0.05 compared with anti-NC group

圖5 miR-29a和NFAT5的靶向關(guān)系驗證

A.RA-FLSs activity after simultaneous over-expression of microRNAs-29a and NFAT5; B, C.RA-FLSs apoptosis rates after simultaneous over-expression of miR-29a and NFAT5;*P<0.05 compared with blank group;#P<0.05 compared with miR-29a group

圖6 miR-29a靶向NFAT5對RA-FLS活力和凋亡影響

NFAT5是一個與滲透壓有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，生物學(xué)功能廣泛[10]。有研究顯示，RA滑膜中NFAT5高表達(dá)，抑制NFAT5表達(dá)可降低RA滑膜增殖和血管生成[7]。本研究顯示，抑制NFAT5表達(dá)可明顯降低RA-FLS活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。雙熒光報告基因檢測系統(tǒng)檢測及過表達(dá)或抑制miR-29a后NFAT5表達(dá)后發(fā)現(xiàn)NFAT5是miR-29a的靶基因。過表達(dá)NFAT5可減弱過表達(dá)miR-29a對RA-FLS活力抑制和凋亡促進(jìn)作用。提示miR-29a可靶向NFAT5影響RA-FLS活力和凋亡。

p38MAPK是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號途徑，在炎性反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、骨關(guān)節(jié)炎等多種生理病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。有報道顯示，骨關(guān)節(jié)炎軟骨中p38磷酸化含量明顯高于健康人群，p38抑制劑可明顯降低軟骨疼痛及退變[12]。抑制p38MAPK信號通路可明顯降低RA-FLS活力和誘導(dǎo)凋亡[13]。說明p38MAPK信號通路與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Caspase3是p38MAPK信號通路下游調(diào)控基因，其活化可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究顯示，RA中cleaved-caspase3表達(dá)明顯降低[14]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-29a或抑制NFAT5表達(dá)均可明顯下調(diào)磷酸化的p38表達(dá)，上調(diào)cleaved-caspase3表達(dá)，提示miR-29a可通過靶向NFAT5抑制p38MAPK信號通路影響RA-FLS活力和凋亡。

綜上所述，miR-29a可通過靶向調(diào)控NFAT5下調(diào)p38MAPK信號通路抑制RA-FLS活力，并誘導(dǎo)其凋亡，可能是RA診療的潛在作用靶點。