人穿孔素在sf9昆蟲細胞中的表達和純化

陳風曄，劉孟雨，周雅博，梁曉雨，黃 波，解 靜

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室 免疫學系，北京 100005)

穿孔素(perforin,PRF)是存在于細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTLs)和天然殺傷細胞(naturalkillercell, NK)胞質(zhì)毒顆粒中的糖蛋白，由550個氨基酸組成，分子量為67 ku。穿孔素為單鏈結構，N端以親水性氨基酸為主，C端則以疏水性為主，穿孔素單體分子被釋放后，在Ca2+存在下活化形成10個以上單體分子組成的管狀結構多聚體，通過其疏水C末端插入細胞膜發(fā)揮作用[1]。CTLs和NK細胞可通過穿孔素—顆粒酶途徑來防御病毒感染或異常細胞侵襲[2-4]。CTLs與靶細胞膜表面抗原接觸，穿孔素被激活后在靶細胞上形成跨膜孔洞，顆粒酶進入細胞，活化caspase級聯(lián)反應，導致靶細胞凋亡[1,5-6]。目前商品化的穿孔素基本上都是使用酵母表達系統(tǒng)表達的蛋白，并不具備細胞打孔活性，難以獲得大量高活性的穿孔素，現(xiàn)有的穿孔素相關研究受到很大的局限。因此優(yōu)化穿孔素的純化方法具有重大意義。故本文旨在用一種簡單方法在昆蟲細胞中表達并純化出有活性的人穿孔素，為相關研究的推進提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和細胞系：人乳腺癌細胞系MCF-7(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心)；昆蟲草地貪夜蛾細胞sf9(spodoptera frugiperda cell 9)和pFastBac1載體(Thermo Fisher公司)。

1.1.2 試劑：DNA酶、PrimeSTARHS DNA Polymerase with GC Buffer、5× In-Fusion HD Enzyme Premix和電泳緩沖液(TaKaRa公司)；快速內(nèi)切酶EcoRⅠ、CellfectinTMⅡ Reagent、快速內(nèi)切酶XbaⅠ、Grace’s Insect Medium和碘化丙啶(Thermo Fisher公司)；Agrose(Invitrogen公司)；桿狀病毒穿梭載體bacmid小量抽提試劑盒、考馬斯亮藍超快染色液、親和層析柱空柱管(12 mL)、和快速銀染試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；瓊脂、酵母提取物、蛋白胨和氯化鈉(Sigma-Aldrich公司)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒和普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；PRF cDNA ORF Clone和SIM SF培養(yǎng)基(Sino Biological公司)；Ni-NTA Agarose(Qiagen公司)；蛋白質(zhì)電泳緩沖液(北京全式金生物技術有限公司)；Anti-His抗體(CST公司)

1.2 方法

1.2.1 pFastBac1-PRF-6×His重組質(zhì)粒的構建：對pFastBac1載體采用快速內(nèi)切酶EcoRⅠ，XbaⅠ進行酶切(37 ℃，30 min)，凝膠電泳后回收4 700 bp的線性化載體；采用PRF引物對人PRF的cDNA進行PCR擴增，PCR反應條件：預變性95 ℃ 5 min；變性98 ℃ 10 s，退火60 ℃ 5 s，延伸72 ℃ 2 min，變性、退火和延伸重復30個循環(huán)，將目的片段進行膠回收。測量A260/280值后，使用5× In-Fusion HD Enzyme Premix將上述片段在PCR儀中與pFastBac1載體進行連接反應(50 ℃，15 min)。隨后將連接產(chǎn)物pFastBac1-PRF轉(zhuǎn)化入Stbl3感受態(tài)細胞，在含1%氨芐青霉素ampicillin(1 000 g/L)的固體LB培養(yǎng)基上涂板，37 ℃過夜培養(yǎng)。第2天挑取單克隆擴增后提取質(zhì)粒并使用PRF(sequencing)引物測序，將測序結果與人穿孔素序列進行比對。

表1 普通PCR擴增引物序列和測序引物序列

1.2.2 pFastBac1-PRF-6×His的轉(zhuǎn)化及桿狀病毒質(zhì)粒bacmid的提取：經(jīng)過測序比對后，將50 ng成功構建的質(zhì)粒pFastBac1-PRF-6×His轉(zhuǎn)化入含有桿狀病毒質(zhì)粒bacmid的DH10α-Bac感受態(tài)細胞中，加入500 μL無菌SOC培養(yǎng)基后，置于搖床培養(yǎng)4 h(37 ℃，200 r/min)。制備含50 μg/mL卡那霉素(kanamycin)，7 μg/mL慶大霉素(gentamycin)，10 μg/mL四環(huán)素(tetracycline)，100 μg/mL X-gal，40 μg/mL IPTG的固體LB培養(yǎng)基，而后取出50 μL菌液涂板，37 ℃培養(yǎng)72 h后篩選出陽性白斑菌落。挑取陽性白色菌落和陰性藍色菌落進行擴增，提取DH10α-Bac中構建成功的bacmid-PRF-6×His質(zhì)粒和構建失敗的bacmid質(zhì)粒。

1.2.3 PCR驗證bacmid-PRF-6×His序列：使用桿狀病毒質(zhì)粒bacmid引物對桿狀病毒質(zhì)粒bacmid-PRF-6×His進行PCR擴增(預變性95 ℃ 5 min; 98 ℃ 10s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 5 min，30個循環(huán))，擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳鑒定。

1.2.4 桿狀病毒(Baculovirus)的制備和擴增：提前將5×105個sf9昆蟲細胞接種到6 cm2的細胞培養(yǎng)皿中，27 ℃培養(yǎng)1 h待細胞貼壁。準備兩個1.5 mL的離心管，各加入100 μL Grace培養(yǎng)基，其中一個加入1 μg bacmid-PRF-6×His質(zhì)粒，另外一個加入6 μL轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Ⅱ Reagent，將兩者輕柔混勻后靜置30 min，加入800 μL Grace培養(yǎng)基輕柔混勻后緩慢滴入接種了sf9的6cm2細胞培養(yǎng)皿中，放置于27 ℃培養(yǎng)。5 h后更換培養(yǎng)基為SIM SF 培養(yǎng)基，繼續(xù)27 ℃培養(yǎng)72 h。72 h后將培養(yǎng)基室溫500×g離心5 min后上清液即為桿狀病毒P1。將200 μL P1病毒加到接種了4×106個sf9細胞的T 25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，置于27 ℃培養(yǎng)72 h后，將培養(yǎng)基室溫500×g離心5 min后獲取的上清液為桿狀病毒P2。將300 μL桿狀病毒P2加到接種了1×107個sf9細胞的T 75 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，置于27 ℃培養(yǎng)72 h，將培養(yǎng)基室溫500×g離心5 min后獲得的上清液為桿狀病毒P3。

1.2.5 穿孔素在sf9中的表達：將1×107個sf9細胞接種到含10 mL 昆蟲SIM SF培養(yǎng)基T 75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，27 ℃培養(yǎng)1 h待細胞貼壁，然后加入人穿孔素桿狀病毒P3 600 μL，27 ℃培養(yǎng)72 h，觀察到細胞核變大，細胞變圓。收集細胞，每個T 75 cm2培養(yǎng)瓶的細胞沉淀加入1 mL非變性細胞裂解液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，pH=8.0)，4 ℃充分裂解細胞后，4 ℃ 15 000×g離心15 min獲取上清。留取50 μL記作CL(celllysate)，剩余液體加入50 μL Ni-NTA agarose，在旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)2 h(4 ℃,30 r/min)。將與蛋白充分結合的agarose裝填在親和層析柱空柱管中，在4 ℃條件下利用重力作用把目的蛋白從His柱上洗滌和洗脫。首先收集裝填過程中的穿流液，記為FT(flow through)。后采用非變性洗滌液洗滌3次(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol咪唑，pH=8.0)，收集每次洗滌的穿流液，記作Wash1-Wash3。再采用不同濃度非變性洗滌液進行梯度洗脫共4次(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，4次洗脫的咪唑濃度分別為20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L，pH=8.0)，收集每次洗脫的穿流液，記作Elution 1-Elution 4[7]。

1.2.6 Western blot檢測和考馬斯亮藍染色鑒定：各取20 μL上述液體進行SDS-PAGE膠電泳后，將凝膠取出加入適量快速考馬斯亮藍染色液室溫20 r/min染色30 min后，加入適量去離子水室溫20 r/min洗滌30 min，共3次，再加入適量去離子水后置于4 ℃ 20 r/min洗滌過夜，第2天將膠取出拍照，選取在67 ku有單一條帶的樣本進行下一步實驗。

1.2.7 人穿孔素的濃縮和定量：將上一步選取的洗脫液加入分子量為30 ku的15 mL超濾管中，4 ℃ 12 000×g離心30 min進行濃縮，隨后取1 μL蛋白與0.1、0.5、1、2 μg牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)作對照進行SDS-PAGE電泳鑒定，根據(jù)快速銀染試劑盒說明書，對凝膠進行染色，脫色后拍照。采用ImageJ軟件對其銀染圖進行吸光度值分析得到其濃度并計算表達量。

1.2.8 人穿孔素的His標簽的檢測：取1 μL純化濃縮后的表達產(chǎn)物采用Anti-His 抗體進行Westernblot檢測重組人穿孔素是否表達。

1.2.9 人穿孔素的活性檢測：將1×105的MCF-7制成100 μL單細胞懸液并置于1.5 mL 離心管中，加入終濃度為2 mmol/L的CaCl2，并分別在離心管中加入0、50、100、200和500 ng的人穿孔素，37 ℃孵育30 min，加入終濃度為100 μmol/L的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，室溫避光放置5 min，使用C6流式細胞儀檢測單個細胞中PE通道熒光強度，結果使用BD Accuri C6 Software、FlowJo以及GraphPad分析，統(tǒng)計PI染色陽性的細胞比例[8]。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 bacmid-PRF1-6×His的構建

對PRF序列進行PCR擴增后，所需目的產(chǎn)物為1 700 bp，獲得4個目的片段(圖1)。經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、藍白斑篩選后，陰性對照藍斑菌落提取的空載bacmid載體的PCR產(chǎn)物在300 bp，白斑菌落提取的正確轉(zhuǎn)化的重組桿狀病毒質(zhì)粒bacmid-PRF1-6×His在4 000 bp，由結果可見bacmid-PRF1-6×His構建成功(圖2)。

L1.marker, L2-L5.PRF repeating amplification productsunder the same reaction conditions

L1.marker; L2.PCR products of bacmid; L3.PCR products of bacmid-PRF1-6×His

2.2 重組人穿孔素的純化及鑒定

經(jīng)桿狀病毒P3感染后的sf9細胞裂解液中表達大量人穿孔素，經(jīng)過洗滌和洗脫后，在Elution 2-Elution 4獲得67 ku的單條帶蛋白，其最佳洗脫條件為：50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，30 mmol/L咪唑，pH=8.0(圖3A)。將不同量牛血清白蛋白BSA(0.1、0.5、1和2 μg)和1 μL純化的人穿孔素的銀染結果進行灰度分析，從被桿狀病毒P3感染的4×108個sf9細胞中得到純化產(chǎn)物總量為763.4 μg(圖3B)。使用Anti-His抗體對純化產(chǎn)物進行Western blot檢測，純化產(chǎn)物中有穿孔素，條帶比較彌散(圖3C)。

2.3 重組人穿孔素的活性鑒定

在2 mmol/L CaCl2在的情況下，穿孔素可以在細胞膜表面打孔[2]，PI染料進入細胞內(nèi)，細胞表現(xiàn)為PI染色陽性。由結果可見：將0 ng穿孔素組作為對照，隨著穿孔素劑量的增加，靶細胞的PI陽性比例上升，說明純化的人穿孔素可以在一定Ca2+離子濃度下使細胞膜排阻能力下降，可能對靶細胞膜進行了打孔，并呈現(xiàn)濃度依賴性，具有生物學活性(圖4)。

3 討論

穿孔素—顆粒酶途徑一直以來都是免疫研究和腫瘤免疫研究中的熱點，腫瘤免疫治療更是最近新興臨床治療的代表[9-10]。傳統(tǒng)的穿孔素分離純化方法是通過PRF高表達的人NK細胞系YT-Indy或者全血活化的T細胞來表達穿孔素，再使用固定化金屬親和色譜法或者差速離心方法進行分離純化[11-12]。受限于蛋白純化儀器AKTA等設備，國內(nèi)的研究者對相關腫瘤免疫的研究因缺少相關蛋白而不得不停滯。

A.purified product of human perforin protein, Coomassie brilliant blue staining; B.silver staining of the purified product of human perforin protein; C.Western blot analysis of human perforin protein using anti-His antibody

圖3 人穿孔素的純化以及定量和定性

Fig 3 Purification, quantify and characterization of human perforin

A.1×105MCF-7 cells were co-incubated with 2 mmol/L CaCl2and different doses of purified human perforin and then stained with propidium iodide，flow cytometry was used to obtain the PI staining results of MCF-7 cells with different doses of human perforin(red value was PI positive percentage); B.PI staining positive percentage of MCF-7 cells with the different dose treatment of purified human perforin;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with 0 ng group

圖4 人穿孔素的生物學活性鑒定

此外，人穿孔素這一類毒蛋白表達和純化過程中工程細胞的毒性耐受能力值得關注。采用人胚胎腎來源的HEK293細胞系表達純化人的毒蛋白，表達出的有活性的人毒蛋白會攻擊HEK293細胞，造成目的蛋白產(chǎn)量的減少和活性減少。昆蟲細胞有完善的加工、修飾系統(tǒng)，形成多亞基組裝等功能，采用不同種屬的昆蟲細胞sf9來表達人源的毒蛋白，提高宿主細胞對毒蛋白的耐受性，使目的毒蛋白的產(chǎn)量得到保證，活性得以保存。一般來說，6×His標簽是融合蛋白中最常用的標簽，工藝成熟且其6個氨基酸大小基本不會影響融合蛋白的結構和功能。就本文而言，His標簽沒有影響純化的人穿孔素的生物學活性，相關性質(zhì)有待進一步實驗的驗證。在本文中，純化出的穿孔素在預期大小67 ku附近，并且采用Anti-His抗體進行Western blot檢測純化產(chǎn)物時發(fā)現(xiàn)條帶較為彌散，這些可能與蛋白的降解和穿孔素的糖基化水平相關。穿孔素是糖蛋白，而不同糖基化水平的糖蛋白在采用Western blot檢測的時候會處于不同的位置，呈現(xiàn)一個彌散的條帶。并且在昆蟲表達系統(tǒng)中，蛋白常常伴隨著糖基化是其一大特性，因此純化產(chǎn)物中可能含有不同糖基化水平的穿孔素，導致了純化的穿孔素大小與條帶彌散的變化。而如何在昆蟲表達系統(tǒng)中控制目的蛋白的糖基化和在蛋白純化過程中如何防止蛋白被降解，還需要進一步的研究。本文采用的簡易純化蛋白方法，得到了大量具有活性的人穿孔素，雖然純度有一定限制，但是使用本文更為經(jīng)濟、簡易的方法完成復雜的蛋白純化，可以讓國內(nèi)剛起步的研究者獲得自己想要的純化蛋白，得以完成相關研究。