Caveolin1在乳腺癌中的作用及其表觀遺傳調控機制

章建萍 金洪傳

Caveolea是燒瓶狀的質膜內陷，直徑在50～100 nm，具有吞吐小泡和信號轉導的功能。在電鏡下，Caveolea 顯示雙極取向，具有薄型結構外殼蛋白Caveolin1（CAV1）和Caveolin2（CAV2）構成的雜合寡聚體條紋［1］。Caveolea這種內陷小窩在許多器官和實體瘤中普遍存在，尤其在脂肪細胞、心肌細胞、內皮細胞和上皮細胞中含量豐富，影響細胞生長、凋亡、血管形成和跨血管物質交換等一系列生理活動［2］。

Caveolin1（CAV1）作為Caveolea 的標志蛋白，是一種分子量21～22 KDa 的跨膜蛋白，由178 個氨基酸組成。其編碼基因Caveolin1 位于7 號染色體的q31.1區域，包含3個外顯子區域［1］。Caveolin1的構象特殊，分為位于細胞質內的親水部分和嵌入質膜形成發卡結構的疏水部分。其N端結構域（1～101位）和C端結構域（135～178位）組成親水區域，N/C末端之間跨越脂質雙分子層的疏水區域（102～134 位），又稱膜結構域。N端（61～101位）氨基酸殘基可相互作用，招募14～16個單體形成寡聚體，可與運輸到細胞膜上的膽固醇相互作用介導其入胞，故又稱寡聚化區。靠近膜結構域的N 端（82～101 位）為Caveolin1 腳手架區（Caveolin1-scaffolding domain，CSD），CSD 介導Caveolin1與各種信號分子結合并抑制其活性，從而實現對信號轉導通路的負向調控。而C端結構域（135～178位）是介導膜附著至高爾基體進行膜融合再生的最小區域［3］。在乳腺組織細胞癌變的過程中，Caveolin1 既充當抑制乳腺癌增殖的抑癌因子的作用又發揮促進乳腺癌轉移的作用，具體機制未明，可能同腫瘤的亞型、分期以及治療反應等相關。

1 Caveolin1在乳腺癌發生發展中的作用

1.1 Caveolin1在乳腺癌增殖中的作用

目前多數研究認為，Caveolin1 能抑制乳腺癌的增殖，在乳腺癌的發生發展中充當抑癌因子的作用［4］。研究顯示，與正常乳腺組織及癌旁組織相比，乳腺癌組織中Caveolin1 蛋白呈低表達狀態，且在正常乳腺上皮細胞中用基因敲減的方法抑制Caveolin1的表達可明顯上調相關腫瘤生長因子，如基質細胞衍生因子-1（SDF-1）、表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞特異性蛋白-1（FSP-1），從而促進乳腺上皮細胞的生長和癌變［5］。此外，Caveolin1也可通過抑制乳腺癌的有氧糖酵解（Warburg 效應）影響乳腺癌的增殖［6］。有氧糖酵解是腫瘤中最常見的能量重組形式，即使在氧氣充足的情況下，腫瘤細胞仍然通過糖酵解的方式快速供能，以滿足其異常活躍的增殖代謝能量需要。機制上，Caveolin1 通過抑制NF-κB 的磷酸化而減少p65/p50 的入核，使其對c-myc 的轉錄激活作用受到抑制，而c-myc作為經典的有氧糖酵解相關蛋白，介導有氧糖酵解的有序進行。因此Caveolin1的高表達可導致葡萄糖入胞和乳酸生成減少，糖酵解關鍵酶乳酸脫氫酶A（LDH-A）和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）的低表達，從而抑制有氧糖酵解過程，導致乳腺癌細胞增殖障礙。近年來，Caveolin1通過抑制細胞自噬而負調控乳腺癌的增殖的作用也得到普遍關注。Caveolin1通過阻礙溶酶體與自噬體相融合，從而抑制自噬溶酶體的產生，阻斷自噬流，進而抑制乳腺癌細胞的增殖［7］。

1.2 Caveolin1在乳腺癌凋亡中的作用

目前，Caveolin1 在乳腺癌凋亡中的作用尚存在一定爭議，促進凋亡和抑制凋亡的研究各有說法［7-10］。關于Caveolin1促進乳腺癌細胞凋亡，有研究發現，在乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231 中，多西他賽（DTX）可上調Caveolin1，從而調節凋亡通路相關蛋白，如Bcl-2 的磷酸化，p53 和Bax 的表達，以及cleaved-PARP的剪切，促進乳腺癌細胞的凋亡［9］。此外，Caveolin1 缺失導致的脂質筏破壞可以上調VATPase 組裝，促進自噬-溶酶體形成促進自噬的發生，從而抑制細胞凋亡［7］。然而，對于Caveolin1 抑制乳腺癌凋亡。在BT474 細胞中，上調Caveolin1 的表達可增強自噬相關蛋白（Beclin-1，輕鏈3-II和Atg12/5）的表達水平，導致自噬體的形成和抑制細胞凋亡［10］。綜上，Caveolin1 對乳腺癌細胞凋亡的影響主要依賴于凋亡相關蛋白以及細胞自噬。然而關于Caveolin1 對自噬的影響是促進還是抑制，目前尚未有統一的認識，這可能與Caveolin1 影響自噬的階段有關。

1.3 Caveolin1在乳腺癌侵襲轉移中的作用

乳腺癌的侵襲轉移是乳腺癌惡性進展的重要特征之一，也是乳腺癌臨床防治的最主要挑戰。目前關于乳腺癌轉移的研究熱點主要集中在上皮-間充質轉化（EMT）、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的改變，細胞骨架重建、血管形成等方面［11］。而Caveolin1 在這些過程中均發揮著重要作用。研究顯示，轉移性乳腺癌MDA-MB-231 細胞中Caveolin1 的蛋白表達明顯高于非轉移性乳腺癌MCF-7 細胞，且在乳腺癌組織中也存在轉移能力與Caveolin1蛋白表達呈正相關的現象［12］。在體外細胞實驗中，百花蛇舌草可有效抑制乳腺癌細胞的轉移，可能因為百花蛇舌草可以抑制Caveolin1 的蛋白表達，從而降低細胞外基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的含量，從而抑制其侵襲轉移的能力［13］。除此之外，Caveolin1 表達的下降也影響了EMT 相關基因的表達，如E-cadherin 表達上升，而Vimentin 以及Snail 和Slug 等EMT 相關轉錄因子表達下降，可抑制EMT 的發生。另外，在高糖引起的EMT過程中，研究者發現抑制雌激素受體信號通路可上調Caveolin1 的mRNA和蛋白表達，促進Slug 表達上調，從而提升乳腺癌的侵襲轉移能力［14］。以上證據提示Caveolin1可通過促進EMT 過程從而促進乳腺癌的侵襲轉移。Rho 家族蛋白是一組分子量為20～25 KD 的三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）結合蛋白，具有GTP 酶活性，亦稱小G蛋白，在多種惡性腫瘤中高度活化，參與調控腫瘤細胞的形態、細胞外基質的黏附和細胞骨架的重構等過程，對腫瘤的侵襲轉移具有重要的調控作用［15］。在轉移性乳腺癌中，Caveolin1 高表達激活Akt1 信號通路，磷酸化激活RhoC GTP 酶，從而促進乳腺癌細胞的黏附和遷徙［16］。此外，Caveolin1 的第14 位酪氨酸發生磷酸化激活，可通過上調Rab5（Ras-related protein 5A）的表達從而激活另一Rho 家族蛋白Rac1，Rac1 能以分子橋梁的形式與胞內各種分子進行結合，激活各種信號通路，如PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而促進細胞骨架重塑和細胞侵襲轉移［17］。

另外，Caveolin1還可以依賴于另一種重要分子-整合素（integrin）促進乳腺癌細胞的侵襲轉移［18］。整合素是一種位于細胞表面依賴Ca2+、Mg2+的異親型細胞黏附分子，介導細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質之間的相互識別和黏附。由于細胞的侵襲轉移需要細胞偽足與ECM 形成穩定黏附，從而提供細胞向前遷移的牽引支點。因此整合素作為連接細胞外基質和胞內肌動蛋白骨架的跨膜接頭，其胞外結構域與細胞外配體（如纖黏連蛋白和層黏連蛋白）結合，導致胞內結構域末端構型發生改變，使得胞內結構域與相鄰蛋白的互作發生變化，從而激活一系列信號級聯反應，并與細胞骨架相連，提供細胞遷移的錨著位點［19］。促轉移蛋白NEDD9 可通過Caveolin1 調控整合素的細胞內轉運以及細胞膜定位表達。表達Caveolin1 的囊泡可將與配體結合的整合素內吞入胞，促進配體與整合素解離而釋放整合素，從而在細胞的黏附和遷徙中發揮重要作用。當NEDD9 缺失，盡管整合素表達無變化，但卻顯著影響細胞膜表面整合素的黏附能力；過表達14位酪氨酸磷酸化的Caveolin1則可恢復整合素活性促進細胞運動侵襲［18］。

因此，Caveolin1 可通過調控上皮-間質轉化、細胞外基質的改變、Rho家族蛋白和整合素內吞等在乳腺癌侵襲轉移中發揮重要作用。

1.4 Caveolin1抑制乳腺癌干細胞的干性形成

腫瘤干細胞是腫瘤中具有自我更新能力并產生異質性腫瘤細胞的細胞。在乳腺癌中已發現乳腺癌干細胞（BCSC）在乳腺癌的增殖、轉移和復發中起著關鍵作用［20-21］。目前，越來越多的研究開始關注到Caveolin1 在乳腺癌干細胞的干性形成中的生理作用。有研究指出，Caveolin1 在乳腺癌的干性形成中起著抑制作用。在起源于乳腺癌細胞的克隆球中，Caveolin1 的表達明顯下調，且抑制Caveolin1 可上調腫瘤干性相關指標（CD44/CD24），促進乳腺癌干細胞的自我更新能力，從而促進乳腺癌的惡性腫瘤學行為，如EMT和侵襲轉移［20］。此外，Caveolin1可通過cmyc 介導的腫瘤代謝重編程抑制乳腺癌干細胞的自我更新能力和有氧糖酵解［21］。機制上主要表現為抑制Caveolin1可減少E3連接酶VHL 與c-myc 結合，緩解c-myc 蛋白的泛素化降解，促進c-myc 的積累，從而導致c-myc介導的有氧糖酵解有序進行，為乳腺癌干細胞的自我更新能力提供能量支持。

1.5 Caveolin1介導乳腺癌治療藥物的內吞

Caveolin1 介導的細胞選擇性內吞是將細胞外物質通過細胞膜形成的內陷囊泡選擇性地輸送到細胞內的膜性區域。因此含有Caveolin1的囊泡可以攜帶不同的特異性蛋白觸發小窩的內吞作用并運輸到特異的細胞器中。該選擇性內吞作用在細胞運動、遷移等過程中發揮重要作用，同時對治療藥物的代謝也產生深遠的影響［22-24］。

在乳腺癌治療過程中，有些藥物如白蛋白紫杉醇和T-DM1 的入胞依賴于Caveolin1 介導的選擇性內吞［22-23］。作為新一代紫杉醇制劑，白蛋白結合型紫杉醇（白蛋白紫杉醇）是三陰性乳腺癌化療的一線用藥，在乳腺癌等惡性腫瘤的化療中占據極其重要的地位。白蛋白作為紫杉醇的載體可與Caveolin1 結合，通過內吞小泡轉運入胞，同時紫杉醇隨白蛋白入胞，發揮其抗腫瘤活性［22］。因此Caveolin 1 蛋白高表達的乳腺癌往往伴隨較好的白蛋白紫杉醇治療效果［25-27］。此外，Caveolin1 介導的內吞也是T-DM1 入胞的重要機制。作為晚期HER-2陽性乳腺癌靶向治療的二線用藥，T-DM1 是曲妥珠單抗和抗微管藥物美坦辛組成的抗體偶聯藥物。研究顯示Caveolae 介導的內吞是HER-2+乳腺癌T-DM1 耐藥的重要機制。在T-DM1 耐藥的HER-2+乳腺癌細胞中，Caveolin1 高表達，T-DM1 經Caveolea 介導的內吞入胞，在胞內與溶酶體融合，而溶酶體內腔的酸性環境將削弱T-DM1的藥物療效［23，28］。因此Caveolin1可能成為治療T-DM1耐藥的一個重要靶點。

1.6 Caveolin1對臨床預后的指示作用

在侵襲性乳腺癌中，間質細胞中Caveolin1 的表達與腫瘤大小、組織學分級和淋巴結轉移有關，因此Caveolin1 可能成為腫瘤預后的臨床診斷指標。Yeong 等［29-30］對71 例侵襲性乳腺癌患者進行組織學分類和分期，評估患者組織標本的血管轉移、淋巴結轉移、乳腺癌組織炎癥性改變、淋巴結浸潤、雌激素受體ER 表達、p53 突變、HER-2 表達、Ki-67 增生指數、原位復發和轉移能力，統計預后生存期，檢測其間質細胞和腫瘤細胞中Caveolin1 的蛋白表達發現，基質細胞中Caveolin1 高表達與良好的預后有關，間質細胞中Caveolin1表達或高表達的乳腺癌患者其總生存期和無病生存期均高于Caveolin1不表達或者低表達患者，提示間質細胞中Caveolin1 的表達水平與乳腺癌患者預后呈正相關，但是腫瘤中Caveolin1 的表達對預后生存并無指示意義。此外，間質細胞中Caveolin1的表達還與乳腺癌中雌激素受體（ER）的表達呈負相關，與腫瘤轉移性狀呈正相關。在發生淋巴結轉移的乳腺癌中Caveolin1的表達明顯高于無淋巴結轉移的乳腺導管內原位癌，表明Caveolin1 的高表達與乳腺癌的浸潤轉移有關［29-30］。雖然Caveolin1的存在預示著乳腺癌的高轉移風險，但在總生存期上，Caveolin1仍然與良好的預后有關，這可能跟Caveolin1 的時空特異性表達，以及抑癌作用和促癌作用之間相互抗衡的結果有關。此外，Caveolin 1 在乳腺癌中的高表達預示著乳腺癌對白蛋白紫杉醇敏感。在轉移性乳腺癌中，免疫組織化學法檢測提示Caveolin1 高表達者對白蛋白紫杉醇的完全病理緩解率明顯高于Caveolin1 低表達的乳腺癌患者，為今后指導臨床用藥提供了參考依據。

2 Caveolin1表達的表觀遺傳調控機制

鑒于Caveolin1 在腫瘤中的重要作用，其表達調控也越來越受到關注。其中表觀遺傳調控紊亂在腫瘤相關性Caveolin 1表達異常中發揮了至關重要的作用。表觀遺傳調控指非DNA序列變異引起基因表達水平的改變，導致“可遺傳”的表型變異現象。目前，經典的表觀遺傳調控主要可分為DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑和非編碼RNA 的調控。其通過對基因轉錄或翻譯過程的調控，影響基因的功能和特性，極大豐富了基因表達的多樣性［31-32］。

2.1 DNA甲基化

DNA甲基化作為與腫瘤發生發展聯系最為密切的表觀遺傳調控方式，近年來為研究的熱點。傳統的CpG島（C：胞嘧啶，p：磷酸，G：鳥嘌呤）甲基化被認為是抑癌基因轉錄抑制的最常見形式，也是人類腫瘤所具有的共同特征之一。CpG 島中胞嘧啶殘基上第5 個碳原子甲基化（5mC）是首次在DNA 發現的共價修飾，也是目前最廣泛的DNA 修飾［33］。隨著CpG島甲基化的發現，CpG島上下游的保守序列CpG海岸的高甲基化狀態也隨之浮出水面。然而研究發現，CpG海岸的高甲基化狀態與轉錄沉默相關，但并非完全等同轉錄沉默，這一特異現象可能跟腫瘤的異質性有關，但具體機制尚不清楚。在胃賁門腺癌中，Caveolin1作為抑癌因子，其CpG島高甲基化抑制Caveolin1 低表達，促進腫瘤進展，與胃賁門腺癌的不良預后相關［34］。而在乳腺癌中，Caveolin1 作為介導侵襲轉移的重要因子，其表達亦受表觀遺傳調控［35］。研究發現在乳腺癌細胞系中，通過對Caveolin1 表達的全基因組DNA 甲基化圖譜整合分析，Caveolin1 的CpG 海岸甲基化（而非CpG 島）差異顯著調節Caveolin1 的表達。在Caveolin1 低表達、侵襲能力較弱（盡管啟動子CpG 島低甲基化）的乳腺癌細胞系中，DNA甲基轉移酶抑制劑可削弱CpG 海岸甲基化程度，誘導Caveolin1 表達。而在侵襲性乳腺癌中，CpG 海岸低甲基化提示Caveolin1的高表達［36］。因此Caveolin1的CpG 海岸低甲基化預示乳腺癌的高侵襲性，與乳腺癌患者預后生存呈負相關，提示Caveolin1 的CpG海岸甲基化可能成為臨床乳腺癌生存預后的評估指標。

2.2 組蛋白修飾

組蛋白修飾是指組蛋白在相關酶作用下發生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP 核糖基化等修飾的過程，為表觀遺傳調控的手段之一，在基因轉錄過程中發揮重要作用。目前對組蛋白修飾的研究主要集中在組蛋白甲基化和組蛋白乙酰化，甚至兩者的協同作用。組蛋白甲基化通常發生在賴氨酸和精氨酸，且對基因表達的影響也與甲基化的位點和數量有關，如H3K4的甲基化常發生在轉錄活躍的啟動子區，而H3K9甲基化又與轉錄抑制和異染色質有關。組蛋白乙酰化是組蛋白乙酰轉移酶（HATs）和組蛋白去乙酰化酶（HDAC）協調作用的結果。高乙酰化常提示基因表達激活，而低乙酰化常與基因表達抑制相關。在結腸癌中，Caveolin1 處于低表達狀態，而過表達Caveolin1 可顯著提高結腸癌的凋亡、抑制生長。研究發現Caveolin1 的表達受H3K4me3，H3K9AcS10P，H3K9me3 共同調控。結腸癌細胞的DNA 甲基化分析顯示，Caveolin1 啟動子區CpG 島未甲基化，提示DNA 甲基化與Caveolin1 的表達和結腸癌患者預后并不相關。既往研究發現DNMT抑制劑AZA的使用可降低DNA甲基化水平，促進組蛋白H3 乙酰化的增加和活性H3K4me3 標記的積累，也提高了從組蛋白尾部去除H3K9me3 的能力。因此AZA 的使用促進Caveolin1 啟動子附近H3K4me3 和H3K9AcS10P 的富集，可促進Caveolin1的轉錄激活，同時H3K9me3 水平的下降也解除了H3K9甲基化對Caveolin1轉錄的抑制作用，組蛋白甲基化和乙酰化共同促進了Caveolin1 的表達。而HDAC 抑制劑TSA 的使用明顯上調H3K9AcS10P 水平，從而協同促進Caveolin1 的表達，抑制腫瘤生長［37］。因此HDAC 抑制劑在腫瘤治療尤其乳腺癌治療中，可顯著改善患者生存獲益。而在乳腺癌中，雖然Caveolin1表達受HDAC 抑制劑調控的具體機制尚未被報道，但由于HDAC抑制劑在乳腺癌中良好的獲益，相信在不久的將來Caveolin1 受H3K9AcS10P 調控的機制可在乳腺癌中被重復。

2.3 非編碼RNA（ncRNA）的調控

ncRNA指無蛋白編碼功能的RNA。根據是否核苷酸數量＞200 nt，可大致分為“小非編碼RNA”和“大非編碼RNA”。小非編碼RNA 包括小型核仁RNA（snoRNA），PIWI 相互作用RNA（piRNA），小干擾RNA（siRNA）和microRNA（miRNA）。這些RNA 具有高度的跨物種序列保守性，可與目的基因進行特異性堿基配對，參與基因轉錄和轉錄后沉默。而長鏈ncRNA（lncRNA）跨物種序列保守性較差，因此在轉錄調控中的作用機制更加多樣，也可能充當各種染色質調節劑的分子伴侶或支架，對基因表達存在一定的調控。在乳腺癌中Caveolin1的表達受到miRNA的調控最受關注。研究者發現，miRNA-192 通過靶向結合Caveolin1的3′UTR，抑制Caveolin1的翻譯，從而抑制乳腺癌的增殖，提示miRNA-192 可能是乳腺癌治療的一個新靶點［38］。此外，miRNA 對組蛋白甲基轉移酶MML1 的翻譯抑制介導Caveolin1 的轉錄表達的具體機制也被揭示。miRNA-193a 與MML1 的3′UTR 結合，靶向抑制MML1 的翻譯，導致MML1 介導的H3K4me3 水平下降，下游Caveolin1 的轉錄水平隨之受到抑制［39］。因此，miRNA 已成為Caveolin1 表觀遺傳調控的重要機制，而針對Caveolin1 表觀遺傳調控的治療也許可為臨床實踐開啟新思路。

3 結論

隨著Caveolin1在乳腺癌發生發展中的作用和具體分子機制研究受到廣泛關注，Caveolin1 在乳腺癌的增殖、轉移、治療和臨床預后指導中均發揮著舉足輕重的作用。然而由于乳腺癌病因機制的復雜性和腫瘤的異質性，Caveolin1 在不同分子亞型中的表達和作用機制迄今仍不明確。Caveolin1在乳腺癌的增殖中發揮抑癌因子的作用，但對乳腺癌的轉移卻起到促進作用，促進腫瘤的發生發展，其原因可能與腫瘤的分期和狀態有關，Caveolin1 表達的時空特異性也對此有一定的調控作用。因此明確Caveolin1在乳腺癌的發生發展中的雙面作用，有利于為臨床提供一個新的靶點和治療新思路。