銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統結構及調控機制的研究進展

張 鴻，陳 煒

銅綠假單胞菌為條件致病菌，是醫院感染最常見的病原體之一[1]。銅綠假單胞菌的毒力分泌系統共有5型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型。細菌可以通過毒力分泌系統適應生存環境、向宿主細胞注入毒力因子、逃避宿主細胞的吞噬等，以此達到生存、復制、感染、傳播的目的[2]。目前，普遍認為Ⅲ型分泌系統（Type Ⅲ secretion system，T3SS）與銅綠假單胞菌急性感染密切相關，是銅綠假單胞菌感染宿主細胞并致病的最關鍵、最復雜的毒力系統[3]。

1 T3SS的結構與功能

T3SS在耶爾森菌屬、沙門菌屬、福氏志賀菌、幽門螺桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌中廣泛存在[4]，1996年首次發現銅綠假單胞菌的T3SS，2005年確定結構，其結構高度保守，其裝置橫跨細菌內外膜，并延伸形成針狀結構，針狀結構頂端還有一個接觸宿主細胞膜形成孔道的易位復合體。因T3SS總體結構與醫用注射器形狀相似，故又將T3SS復合體裝置稱為T3SS注射體（injectisome）[5]。

該注射體由約3 0 種蛋白組成，根據功能可將組成蛋白分為4 類，即細菌膜裝置蛋白（bacterial membrane apparatus protein）、轉位子蛋白（translocon protein）、效應蛋白（effector protein）和分子伴侶（chaperone）[4]。細菌膜裝置蛋白是T3SS的結構基礎，其裝配過程猶如現代工廠般有條不紊。首先是“生產零件”，即由相關基因表達產生蛋白，如PscN、YscJ等；然后是“結構部件組裝”，即按照結構需求將蛋白組裝成環狀、桿狀等；最后是完成“總體組裝”，即各個結構部件在細菌內外膜上有序組裝形成具有功能活性的注射體。轉位子蛋白主要是指與宿主細胞接觸并可注射細菌毒素或蛋白的部分，又可稱為膜孔復合體，主要由Pcr V[6]、Pop B/Pop D復合體[7]組成。雖然細菌在適應環境過程中可以產生諸多特異性的效應蛋白，但銅綠假單胞菌T3SS效應蛋白目前發現并公認的有以下4種，即胞外酶U（ExoU）、胞外酶S（ExoS）、胞外酶T（ExoT）和胞外酶Y（ExoY），近期有研究稱發現了新的效應蛋白PemA、PemB，但是其具體功能尚不明確[8]。由于編碼ExoU和ExoS的基因相互排斥，故兩者幾乎不在同一菌株中同時出現[9]，攜帶不同基因的銅綠假單胞菌在致病性、耐藥性等方面存在差異[10]。銅綠假單胞菌T3SS效應蛋白均具有一定的酶活性，如ExoU具有磷脂酶A2活性，可導致宿主細胞快速裂解；Exo T和Exo S合成序列之間具有高度同源性，其C-端具有ADP-核糖基轉移酶（ADPRT）結構域，N-端具有GTP酶激活蛋白（GAP）結構域。有報道，ADPRT和GAP結構域對于ExoT在靶上皮細胞中的細胞毒性均有作用，而ExoS誘導的細胞凋亡則主要是依靠ADPRT 活性[11]。ExoY具有腺苷酸環化酶活性，體外實驗證明Exo Y具有促進感染細胞過度磷酸化、阻礙血管修復等毒性作用[12]。這些效應蛋白不僅可以促進銅綠假單胞菌對宿主細胞膜的損傷、抑制宿主炎性介質介導的免疫反應，還可以阻礙宿主細胞損傷后修復過程。T3SS的分子伴侶多為小分子（＜20 kDa）酸性蛋白，可特異性地與效應蛋白結合，保護效應蛋白在宿主胞質內不被降解，從而順利地完成分泌和轉移[4]。

研究表明，T3SS是銅綠假單胞菌急性感染建立和傳播必備的主要毒力因子[1，11]，其致病作用主要來源于：①T3SS被激活時，其針狀結構與宿主細胞接觸，膜孔復合體頂端的PcrV、PopB/PopD蛋白復合體可在宿主細胞膜上打孔，破壞宿主細胞膜的完整性[13]。有研究證明，即使當T3SS分泌蛋白基因被抑制時，T3SS依然可以對宿主細胞膜造成損傷；②T3SS還可以編碼IpaA、IpaB等蛋白，與宿主細胞膜整合素進行整合[14-15]，促進宿主細胞膜形成偽足吞噬銅綠假單胞菌，從而巧妙地逃脫宿主上皮細胞、巨噬細胞等細胞的吞殺；③T3SS效應蛋白具有酶活性[9-12]，可以破壞宿主細胞的正常代謝，破壞宿主細胞的細胞骨架，在體內引起炎癥級聯反應，甚至殺死中性粒細胞，導致宿主局部免疫功能抑制，誘發細胞凋亡，促進銅綠假單胞菌在宿主體內大量繁殖與播散，從而誘發宿主發生感染播散或復數菌感染。總之，T3SS可以通過多種方式和途徑參與細菌致病過程。

2 T3SS的調控機制

T3SS相關基因的有序表達是其功能實現的前提，是銅綠假單胞菌在宿主體內生存、繁殖和播散的基礎。銅綠假單胞菌T3SS的43個編碼基因中，與分泌、轉位和調節相關的5個操縱子（p s c U T S R Q P O N、p o p N-p c r 1 23 4 D R、p cr G V H-p o p B D、e x s C E B A和e x s D- p s c B C D E F G H I J K L）在染色體上彼此相鄰形成了毒力島，而編碼效應蛋白、分子伴侶的基因則位于染色體的其他位置 [16]。

2.1 ExsA對T3SS的調控

T3SS的所有基因均受轉錄因子Exs A直接調控，其結合位點位于靶基因轉錄起始點上游約51～52個堿基處的TNAAAANA保守序列[17]。Exs A是一種Ar a C轉錄激活子，可通過毒力島操縱子exs C E B A和exs D-ps c B C D E F G H I J K L實現自調控。e x s C E B A可編碼蛋白Exs C、Exs E 和Exs A，exs D- psc B C D E F G H I J K L可編碼ExsD。當ExsD與ExsA結合時可抑制ExsA的DNA結合活性，從而抑制T3SS轉錄；而當Exs C與Exs D結合時，可以促進Exs D釋放Exs A，從而間接促進T3SS轉錄；當ExsE與ExsC結合時，又可以促進ExsC釋放ExsD，Exs D與Exs A恢復結合，從而對T3SS起到抑制作用[18-19]。ExsE除了可以與ExsD直接結合抑制T3SS外，還可作為分泌蛋白直接與ExsA結合促進T3SS表達。其作為分泌蛋白調控ExsA的過程可受到多種因素影響，如宿主接觸、血清接觸等，其中生存環境中Ca2+濃度的影響最為顯著[20]。當銅綠假單胞菌處于高Ca2+環境時，蛋白質分泌受到抑制，ExsE在胞內大量囤積，通過直接與ExsD結合，從而抑制T3SS的表達；當銅綠假單胞菌處于低Ca2+環境時，可促進ExsE的分泌，從而使T3SS處于高表達水平。當然，Ca2+的調控作用并非如此單一，還可以通過環磷酸腺苷（cyclic AMP，cAMP）途徑實現對T3SS的調控[21]。

2.2 cAMP對T3SS的調控

2 0世紀6 0年代早期，c AMP在液化短桿菌（Brevi bact erium l i que faci ens）的研究中作為信號分子被首次識別，目前人們認為c AMP是細菌中廣泛存在的信號分子[22]。它是靶細胞在第一信使作用下產生的第二信使，由腺苷酸環化酶產生，可通過蛋白磷酸化作用并結合CRP家族轉錄因子[23]，從而發揮信號轉導的功能。銅綠假單胞菌中與c AMP結合的CRP轉錄因子是Vfr（virulence factor regulator）（PA0652）[24]。有證據表明，與野生菌株相比，當c AMP或Vfr缺失突變時，銅綠假單胞菌約有200個基因表達水平會下調[25]。由此可見，cAMP的作用范圍甚廣，有報道稱cAMP與銅綠假單胞菌的群體感應系統、細胞外蛋白酶、外毒素A、Ⅳ型菌毛、Ⅱ型分泌系統、Ⅲ型分泌系統、las群體感應系統等多種毒力因子的調控有關。有遺傳互補實驗證明，過量表達ExsA可以彌補vfr基因或cAMP合成基因缺失突變的影響，但是vf r基因或cAMP合成基因過量表達不能彌補exsA基因缺失突變的影響，證明vfr基因或cAMP合成基因是在ExsA上游或平行水平對T3SS進行調節。至于到底是作用于ExsA上游還是與ExsA平行調節，科學家進行了大量研究，近期有人通過凝膠遷移實驗確定了Vfr的DNA結合位點，證明Vfr是通過與exsA上游的啟動子PexsA結合對T3SS進行調控[26]。

2.3 雙組分系統及小RNA對T3SS的調節

雙組分系統（t wo-c o mpo n e nt r e g ul a t o r y syst em，TCS）是上世紀80年代Nixon等[27]研究大腸埃希菌氮調節蛋白系統時發現的一種跨膜信號轉導系統。該系統在細菌、真菌、原蟲及一些植物中廣泛存在，其主要作用是識別外界信號并將信號轉導至胞內，從而對細胞代謝、滲透調節、致病性、耐藥性、光合作用、趨化性等進行調控，經典的TCS由組氨酸蛋白激酶（hi st idi ne protein kinase，HPK）和反應調節蛋白（response regulator protein，RR ）組成，參與銅綠假單胞菌調節的有64個HPK、72個RR和3個Hpt蛋白（含有HisHis磷酸轉移蛋白）[28]。對銅綠假單胞菌T3SS具有調節作用的TCS包括Ga c S-Ga c A、Gl t R、SadA-SadR-SadS、AlgB-FimS（AlgZ）等，研究最多的是GacS-GacA[29]。TCS中GacS-GacA及其下游小RNA（RsmY和RsmZ）對銅綠假單胞菌毒力因子進行調節的系統被稱為GAC系統[29]。GAC系統的調控途徑是：當GacS接收外界環境刺激信號后，可使Gac A發生磷酸化，磷酸化的Gac A可正向調節小RNA（RsmY和RsmZ）的表達，RsmY和RsmZ可以與誘導ExsA表達的RsmA結合，抑制RsmA活性，從而負向調節Exs A，抑制T3SS的表達。Ventre等[30]發現GAC系統中，傳感器激酶LadS（PA3974）和RetS（PA4856）具有與GacS平行的作用，LadS系統可以通過GAC系統正向調控具有抑制T3SS作用的操縱子pel（PA3058至PA3064），而RetS則與Gac S之間異二聚體的形成阻斷了后者的自磷酸化能力，干擾了隨后向GacA的磷酸化轉移，并導致RsmZ表達的減少，RsmA促進急性毒性相關基因表達，T3SS表達上調。GAC系統除了可直接對ExsA產生影響外，還可以通過RsmA對群體感應系統、生物膜形成等產生影響[31]。GAC系統還可通過對T3SS和T6SS表達的調節介導銅綠假單胞菌急性毒性和慢性毒性之間的轉換[32]。

2.4 群體感應系統對T3SS的調節

1970年，首次報道了單個費氏弧菌（Vi b r i o fi sheri）不發光，細菌密度增高時發綠色熒光的現象。1983年，在費氏弧菌中找到了群體感應和基本模型[33]。從此人們對于微生物適應環境、感染致病、抵御天敵等方面的社會行為有了全新的認識，關于群體感應系統的研究也不斷升溫。群體感應系統是一種在細菌種內或種間通過化學信號分子彼此感知、交流、相互協調的機制[4]。根據信號分子不同，銅綠假單胞菌群體感應系統可分為las、rhl和喹諾酮（pseudomonas quinolone signal，pqs）系統[34]。三種群體感應系統之間存在一定的級聯關系，pqs系統可由las系統正向調節，由rhl系統負向調節，同時pqs系統又可正向反饋調控rhl系統[35]。孔偉娜等[36]采用基因敲除的方法證明，rhl對T3SS具有負向調節作用，pqs系統對T3SS相關基因（exoS和exo T）具有負向調節作用，但是對于基因ex o Y和操縱子exs D-psc A-L沒有調節作用，并且證明了pqs系統與rhl系統對T3SS的調控途徑是不一樣的。關于兩者對于T3SS的具體調節機制目前仍不清楚。

2.5 PtrB對T3SS的調節

銅綠假單胞菌還存在一種為了生存而協調基因調節，抑制T3SS表達的情況。因為銅綠假單胞菌T3SS裝置的構建、裝配及分泌等過程均需要花費大量的能量，所以細菌DNA受到損傷時，該菌會啟動SOS損傷修復系統。該修復系統一旦啟動便可以促進PtrB蛋白產生[37]，目前有研究證明該蛋白具有抑制T3SS、促進綠膿素分泌的作用，但是其對T3SS的具體作用位點、調節機制等仍有待進一步深入研究。

2.6 ArtR對T3SS的調節

近期，Kong等[38]發現了一種不依賴于GAC調節系統的全新的T3SS調節因素，即三磷酸腺苷結合蛋白Art R。AtrR是銅綠假單胞菌PA4595基因編碼的一種調節因子，由三磷酸腺苷激活后可抑制T3SS基因表達。通過實驗證明，當a rt R敲除時，T3SS基因，包括exo S、exo Y、e x oT、exs C E B A和ex s D-p sc B L的表達顯著增加，ArtR對Exs A的影響是在轉錄水平，而不是翻譯水平。Art R的調節作用和細胞質定位表明它屬于三磷酸腺苷結合盒家族的REG亞家族。純化的GST標記的Art R在體外顯示ATP酶活性。

3 總結與展望

銅綠假單胞菌T3SS是銅綠假單胞菌的重要病毒因子，經過無數科學家20余年的努力探索，目前已經明確了其結構模型，認識到T3SS是通過破壞宿主細胞膜完整性、誘導細胞凋亡、抑制宿主防御系統等方式來發揮急性毒性。銅綠假單胞菌擁有龐大的細菌基因組（6.3 Mb），其中有8%的編碼調節基因組[39]，這預示著銅綠假單胞菌具有響應各種動態環境信號的復雜調節網絡，新的調控因素及機制被不斷發現，銅綠假單胞菌T3SS調控網絡的大幕正在徐徐揭開。隨著研究不斷深入，關于T3SS的調控因素及調控機制的認知正在逐漸完善，為今后以T3SS作為銅綠假單胞菌感染防控靶點的研究提供新的理論依據。