微生物發酵制藥技術

白立勇，葛新霞，王建華

（山東省醫藥工業設計院，山東濟南 250000）

1 微生物發酵概述

1.1 概念

微生物發酵就是給微生物提供適宜生存的環境，通過微生物來對材料的性質進行改變，并最終獲得目標產物的過程。在這一過程中，影響產物的主要因素包括原料、菌種和環境，不同的原料和不同的菌種，在不同的環境下會產生不同的東西，當然，在發酵過程中，由于生產環境的變化，很可能不會產生目標產物，甚至產生一些有毒有害的產物，這就需要對發酵環境進行精確控制。在現代制藥工程中，很多發酵過程生產單額藥品，都是初級代謝產物或副產物，這對發酵控制就有更嚴格的要求，工藝難度也更大。

1.2 應用

目前，該技術在很多領域都有所應用，比如說食品行業，最常見的就是釀酒和酸奶，日常生活中蒸饅頭的過程，實質上也是一種微生物發酵的過程。在化工領域，更多的是生產農藥，比如生物農藥和殺蟲劑等。在醫藥領域，該技術的出現可以說救了無數人的生命，在二次世界大戰爆發的時候，青霉素通過該技術實現了工業化生產，現如今的抗生素、氨基酸等很多藥物，也是通過該技術工藝實現的。但由于該生產的過程是微生物自發進行的，所以在制藥領域如何更精準地控制微生物，把握發酵的進程，并回收需要的產物，成為技術發展的核心與關鍵。

2 細胞培養微載體的類型

2.1 經典型細胞培養微載體

首先是電荷型光面微載體，該載體研發的時間為1967年，使用DEAE-Sepha-dexA50凝膠，用DEAE-Sepha-dexA50凝膠當做培養細胞的載體物質，該凝膠已經經過N，N-二乙基乙醇氨的處理，所以其表面十分光滑，在處理之后其自身所攜帶的正電荷數值約為3.5meq/g，利用電荷相互吸引的特質，使得細胞都可以較好地吸附并黏貼在微載體物質的表面上。電荷型光面微載體已經成為了當前GE 公司較為經典的一類細胞微載體產品。我國相關學者開展了Cytodex1微載體的一系列研究工作，針對該微載體的利用率以及最高細胞密度數值等進行了探究。經過實驗證明，若微載體的濃度提升，那么其最大細胞的密度就會呈現出下降的趨勢，在3g/L 時的用量，其狀態最佳，不管是細胞貼壁的面積還是微載體的利用率數值都比較高。Cytodex1 微載體并不會存在動物源的組成成分，所以其微載體的生物性能比較好，安全性也比較強。和其相關的細胞生長技術的操作性也比較強，可以大致滿足相應的動物細胞規模培養標準要求。其次是膠原包被型微載體，Cytodex1細胞實際的適用范圍相對來說會比較廣泛，但是其并不適用于一些表面黏附以及功能性低下的細胞，若將該微載體應用到其類型的細胞內，那么其細胞的附著率極為低下，且各類細胞的生長速度也比較慢，細胞凋亡的現象比較明顯，細胞很容易產生脫落等的問題。想要構建出一種生物相容性比較強的細胞附著表面，就需要借助豬皮Ⅰ型膠原蛋白，采取共價連接的形式，讓其交聯在Sephadex 微球表面上，開發Cytodex3及同類包被膠原覆層等的微載體類型，對Cytodex3進行細胞支架的研究，分析上皮細胞以及上皮性疾病的題外細胞培養模型。

2.2 酶解型細胞微載體

首先是明膠或膠原微載體，在培養經典型細胞微載體時，其總體細胞分離的工序十分復雜，且消化過程的把控難度也較高。微載體主要是將明膠和疏水性礦物油整合在一起，使用攪拌混合的形式，同時進行NaBH4的還原處理，讓其生成淡黃色的明膠微載體。該類型的微載體是一種非剛性球的物質，且其生物的相容性也較強，可以完全性溶解明膠物質，細胞的分離以及收獲十分的簡便。在進行多類細胞培養分析工作，可以使得細胞載體更好的分離。其次是生物降解型微載體，當前，人們開始借助聚乳酸、殼聚糖等物質進行干細胞的培養工作，在細胞支架注入到機體之后，可以直接被降解以及吸收，極大程度地給我國制藥的應用提供了便利。

3 細胞培養微載體在制藥的應用

3.1 蛋白質藥物與疫苗研究

首先是蛋白質藥物的研究，微載體細胞培養技術種類豐富，且相關的工藝模式也十分的靈活，要科學合理地選擇使用灌注、流加等各項工藝技術，同時還需要盡可能地滿足藥物生產的各類實際性需求，使得蛋白藥物的研發工作可以進展得更為順暢，其在我國生產領域中的應用范圍也開始逐漸的變廣。細胞微載體培養技術主要被應用到蛋白藥物的生產以及研發工作中，相關的藥物種類也比較繁雜，各項工藝技術也較為成熟。微載體培養工藝技術的使用會在提升單抗產量的過程中，讓其糖基化水平趨于穩定，保障了單抗的品質。其次是病毒培養與疫苗研究，細胞微載體培養技術在我國病毒培養以及疫苗領域研究的發展速度相對來說較快，一些公司會使用微載體培養技術培養Vero 細胞生產禽流感疫苗，其生產的規模已經擴大到6 000L。

3.2 干細胞培養及組織工程

首先是干細胞的培養，干細胞的分離以及大規模化培養始終是制藥事業發展的核心，采取體外分離技術所獲得的干細胞數量相對來說較少，存在一定的約束限制，根本無法滿足當前我國臨床的實際性需求。以往的干細胞單層培養工作中，其傳代次數逐漸的提升，培養的時間也逐漸延長，這就使得干細胞逐漸的喪失了一定的自我更新能力，同時還讓其朝向多向分化潛能等的特征發展。細胞微載體培養技術的應用不但可以讓細胞基質維持相應的均一性，同時還可以使得細胞在較短的時間范圍內進行高密度的生長，讓干細胞進行體外大規模的培養。其次是組織工程，在組織工程學當中，微載體主要應用到種子細胞大規模性的擴增項目中，讓其作為細胞轉運以及傳遞的重要支架，可以不斷地放大組織過程，同時滿足當前我國制藥日益增長的臨床需求。

4 微生物發酵制藥種類

4.1 菌體發酵

菌體發酵是最傳統的一種發酵方式，這種發酵所得到的藥物，在古代就已經被應用，比2細胞培養微載體在生物醫學的應用

如說冬蟲夏草、茯苓等，都是菌體發酵得到的產物。菌體發酵最大的特點就是過程控制比較容易，一般來說產物的生產速度，與發酵速率是成正比的，即產物獲得最大的時期，就是發酵速度最快的時候，因此在生產中關鍵就在于控制好發酵環境，如果能夠保證環境的相對恒定，那產物合成率就會更高，經濟效益也會更好。

4.2 酶發酵

青霉素就是酶發酵的產物，在現代的制藥體系中，酶發酵已經成為重要的技術，不僅生產出很多救人性命的抗生素，還發明出很多重要的藥品。比如說抗癌的天冬酰胺酶、治療血栓的納豆激酶等。因為酶發酵的產物很多都具有特殊的藥用功能，因此該技術制藥的研發已經成為生物制藥發展的主流方向之一。在該技術中，發酵過程是利用誘導或抑制劑，從而生產出特定發酵產物實現的，這意味著需要在發酵過程中進行更多的控制和干預。為了提高產量，對于菌種的選育、培養基的配制和發酵條件的控制方面，就更為嚴格。

4.3 代謝產物發酵

代謝產物就是伴隨著菌種生長產生的產物，這種產物在發酵過程中一般來說生產比較少，但通過人工的干預，產量也能夠有顯著的提高。生活中經常見到的氨基酸、核苷酸、維生素等藥品，正是代謝發酵得到的。由于代謝發酵需要的產物是與發酵產物摻雜在一起的，所以工藝的難點就在于收集和分離，當然為了提高產量，通過有效的手段也能提高代謝產物的得率。

4.4 轉化發酵

生物發酵是一種利用微生物將原料轉化為產物的過程，轉化發酵正是精準的實現這一過程的一種方法。通過加入多種酶，能夠實現對化合物的目的性加工，從而得到我們想要的具有藥用價值的化學結構。用于降低身體排異反應的可的松，正是采用該方法生產的。當然除了該藥品，很多獨特作用的激素類藥品都是采用該技術，該技術相比于傳統的技術，是生物發酵更深化的發展，是現代科技和制藥技術的結晶。

5 應用與實踐

5.1 培養基

培養基就好比是微生物的溫床，是給微生物成長繁殖用的，培養基中需要根據菌種的培養需求提供配制的營養物質。為了保證能夠生成目標產物，培養基還必須滿足無菌的要求，一般來說培養基分為固體培養基、液體培養基、合成培養基等。不同種類的培養基，適用的培養環境不同，適用的菌種也不同，因此在制藥生產中，一定要根據需求選擇。

5.2 菌種制備

菌種，決定了培養過后能夠得到什么，菌種的優劣，也影響了產物的產率。因此在制藥工程中，菌種的制備和選擇，同樣是重點工作。一般來說，菌種需要在實驗室條件下進行選育、發酵實驗成功后，才能被應用于生產。由于菌種在發展中也會產生品質的變化，這微小的變化是更微觀的體現，是看不見摸不到的，所以對于一條工藝上常用的菌種，為了保證其代代活性不變，還需要進行定期的純化和再次育種。

5.3 種子培養

種子培養是一種由少變多的過程，通常來說，是先在實驗室或小型設備上進行小規模的培養，待培養成熟后，活性達標后，將種子移植到大型發酵罐中，給予所需的環境和營養物質，在一定周期后實現種群的擴大，最終獲得需要的產物。在種子培養和擴大過程中，最容易發生的就是污染，一旦任何流程中被污染，那必然會造成損失，如果不能及時發現，甚至會導致這一次生產完全性的失敗，因此對無菌操作環境的要求極高。除此之外，還需要控制好環境，只有合適的環境，菌群才能擴散生長，因此就要做好培養環境的打造，確保發酵罐能夠得到穩定的溫度控制。

5.4 發酵

種子擴散后，需要經過發酵才能得到所需要的藥品，發酵過程實質上就是種子繁殖生長的過程，在這一過程中關鍵要素就是要保證環境無菌和恒定。因此，任何一批發酵生產過程都是獨立的，即在生產前和生產后，需要進行徹底的蒸汽滅菌，以確保發酵環境的無菌。如果發酵過程需要進行控制，需要添加其他物質，也要求全部進行無菌操作。最好能夠實現自動化操作，避免人工操作帶來的不利影響。

5.5 處理

該流程就是將需要的產物與廢棄物進行分離的過程，該過程根據藥品性質的不同，工藝上有難有易，容易的僅僅需要簡單的步驟就能得到，難的則需要細致的分離工作。發酵產物得到后，進入制劑車間制成不同的劑型，對于其他廢氣產物，則進行無污染處理后，進行回收或者丟棄。

6 結語

綜上所述，隨著我國生物制藥技術的發展，越來越多的優秀藥品被生產出來，為人們的健康做出了貢獻。在應用這些藥品的時，不要忘記生物發酵技術工藝，正因為技術的進步，才能得到那么多優秀的藥品，隨著智能環境控制和自動化生產的普及，該技術將會獲得更大的發展空間。